MaHSFA1和MaHSP70在热处理诱导香蕉抗冷性中的作用

王海波 李璐 苏新国 张昭其 庞学群

摘要：【目的】探讨MaHSFA1和MaHSP70基因在热处理诱导香蕉抗冷性中的作用，为有效延长香蕉贮运期提供参考依据。【方法】从香蕉基因组数据库（http：//banana-genome.cirad.fr/）中搜索到MaHSFA1和MaHSP70基因序列，分别设计特异引物，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测这2个基因在香蕉热处理和低温贮藏中的表达情况。【结果】MaHSFA1基因与其他物种的HSFA1基因同源性较低，仅在HSF DNA-bind区域的保守性很高；MaHSP70基因含有一个HSPA1-2，6-8-like NBD区域，且与其他物种的HSP70基因同源性很高。7 ℃冷藏诱导香蕉果实的MaHSFA1和MaHSP70基因表达量整体上呈下降趋势。经52 ℃热水处理诱导的MaHSFA1基因表达增强，且在热激处理后0.5 h有一个小高峰；在7 ℃低温贮藏过程中，经热处理后的MaHSFA1基因表达量在贮藏4.0 h时迅速升高至最大值，之后又迅速下降；MaHSP70基因表达量在热激处理后0.5 h迅速升高至最大值，约是对照处理（未经热激处理）的4倍，之后逐渐下降。在整个试验过程中除7 ℃贮藏120.0 h外，其他时段热激处理的MaHSFA1和MaHSP70基因表达量均高于对照处理。【结论】采后香蕉果实的抗冷性与MaHSFA1和MaHSP70基因表达增强密切相关，生产上可通过热处理提高香蕉果实的抗冷性，进而延长贮运期。

关键词： 香蕉；MaHSFA1基因；MaHSP70基因；热处理；抗冷性

中图分类号： S668.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-0873-06

0 引言

【研究意义】香蕉属冷敏性水果，贮藏温度低于12 ℃时即发生冷害，因而难以通过低温措施而延长贮运期（陆旺金等，1999；张昭其和庞学群，2008）。热处理是提高果蔬抗冷性的最有效采后处理措施之一（王海波等，2015），但热处理诱导的抗冷机制，特别是有关的信号传导途径目前尚不清楚。因此，对香蕉热激转录因子（Heat shock transcription factor，HSF）和热激蛋白（Heat shock protein，HSP）进行深入研究，有助于揭示热处理提高香蕉果实抗冷性的作用机理。【前人研究进展】HSF-HSP途径是植物响应高温胁迫的主要途径，在植物耐热性的产生过程中发挥重要作用（Wahid et al.，2007）。HSF是HSP的上游调控因子，通过结合到热激元件（Heat shock element，HSE）上而直接启动下游HSP基因的表达（Nover，1987；Harrison et al.，1994）。目前，已有大量研究证实，HSP产生与采后果蔬抗冷性的增强密切相关。番茄果实经热空气处理（38 ℃，48 h）后HSP积累，有效减轻了果实在2 ℃冷藏中的冷害症状（Sabehat et al.，1996）；李果实经热处理后在低温下冷藏，其HSP基因表达仍保持较高水平，果实的耐冷性增强（Sun et al.，2010）。此外，葡萄柚（Rozenzvieg et al.，2004）、葡萄（张俊环和黄卫东，2006）、杨梅（汪开拓和郑永华，2011）等经热处理后均能通过产生HSP或诱导HSP基因表达增强，从而提高采后果蔬在冷藏中的抗冷性。【本研究切入点】本课题组的前期研究结果表明，采用52 ℃热水处理香蕉果实3 min，能有效减轻香蕉果实的冷害症状（Wang et al.，2008，2012；王海波等，2012），但有关热处理诱导香蕉果实产生的抗冷性是否与HSFA1和HSP70基因相关目前尚不清楚。【拟解决的关键问题】对HSFA1和HSP70基因在香蕉热处理和低温贮藏中的表达进行对比分析，探讨这2个基因在热处理诱导香蕉抗冷性中的作用，为有效延长香蕉贮运期提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

香蕉品种为巴西（Musa spp. AAA group cv. Brazil），采自广州市番禺香蕉园，及时运回广东省果蔬保鲜重点实验室。挑选七成饱满、大小均匀、无病虫害及机械损伤的单个香蕉，先后用0.1%漂白粉和0.05%施保功各浸泡5 min，晾干后备用。

热水及低温贮藏处理：将香蕉果实浸入热水处理机（400 L）中，温度52 ℃，时间3 min。热水处理后将香蕉果实放入20 ℃恒溫箱中贮藏3 h（Wang et al.，2012），然后置于7 ℃下贮藏5 d；对照处理的香蕉在20 ℃恒温箱中贮藏3 h，然后置于7 ℃下贮藏5 d。每处理处理100个香蕉，定期取样备用。取样时间点为：20 ℃下0、0.5、1.5和3.0 h；7 ℃下1.0、4.0、8.0、24.0、48.0和120.0 h。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 引物设计 从香蕉基因组数据库（http：//ba-

nana-genome.cirad.fr/）中搜索HSP70和HSFA1基因序列，分别命名为MaHSP70和MaHSFA1，然后采用Primer Premier 5.0设计引物，引物序列为MaHSP70 （5'-GGCAATCAGTTGGCAGAAG-3'和5'-ACCAGCA

GAGGGTGCGTCA-3'）和MaHSFA1（5'-TACCTCCGA

TATGGACATCTTAA-3'和5'-TAGCCCTATTTCCTC

AGTTTCA-3'）。

1. 2. 2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR） 采用TOYO-

BO THUNDERBIRD SYBR■ qPCR Mix 进行qRT-PCR扩增。反应体系20.00 μL：SYBR-Green PCR Master Mix 10.00 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.25 μL，稀释的cDNA 2.00 μL，ddH2O 7.50 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，进行40个循环。为了确认产物的质量和引物的特异性，在融解曲线中分析产物的Tm（融解温度为65～95 ℃）。所有qRT-PCR结果根据内参基因Actin1进行阈值循环数（Ct）值校准，再利用2-△△Ct计算目的基因的相对表达量，重复3次。

1. 3 统计分析

利用DNAMAN对扩增获得的基因序列进行同源性比对分析，通过NCBI网站中的BLAST进行结构域分析，并采用Sigmaplot 12.5制作折线图。

2 结果与分析

2. 1 MaHSFA1和MaHSP70基因的序列分析结果

经DNAMAN比对及NCBI网站BLAST分析可知，HSFA1基因在不同物种中的同源性较低，但在HSF DNA-bind区域的保守性很高（图1的下划线部分）。其中，MaHSFA1与油棕EgHSFA1（XP_010943416.1）的同源性为59%，与海枣PdHSFA1（XP_008777830.1）的同源性为57%，与水稻OsHSFA1（XP_015630421.1）的同源性为53%，与小麦TaHSFA1（AHZ44764.1）的同源性为51%，与拟南芥AtHSFA1（AEE83945.1）的同源性为26%。基于HSFA1基因构建的系统发育进化树如图2所示，油棕EgHSFA1与海枣PdHSFA1先聚为一支，再与MaHSFA1聚为一个大支。

由图3可以看出，HSP70基因在不同物种中保守性很高，含有一个HSPA1-2，6-8-like NBD区域（下划线部分）。MaHSP70与油棕EgHSP70（XP_010937646.1）的同源性为96%，与水稻OsHSP70（XP_015616495.1）的同源性为95%，与野生大豆GsHSP70（KHN13891.1）、烟草NtHSP70（AAR17080.1）、杨树PtHSP70（XP_002-

311161.1）的同源性均为94%，与拟南芥AtHSP70（CAA05547.1）的同源性为92%。基于HSP70基因构建的系统发育进化树如图4所示，MaHSP70在92%处与其他参考物种聚为一支。

2. 2 热激处理及热激后低温贮藏对MaHSFA1基因表达的影响

由图5可以看出，对照处理的MaHSFA1基因表達量在7 ℃贮藏下呈先缓慢升高后迅速下降的变化趋势，主要表现在前4.0 h有一个较小的增幅，之后逐渐下降至最低水平，且低于处理前的表达量。MaHSFA1基因表达在热水处理后0.5 h有一个小高峰，且在0.5～3.0 h的表达量一直高于对照处理；在7 ℃低温贮藏过程中，经热水处理的MaHSFA1基因表达量在7 ℃贮藏4.0 h时迅速升高至最大值，之后迅速下降，至8.0 h时其表达量已接近处理前的水平，后期MaHSFA1基因表达量继续下降至最低水平。在整个试验过程中，除7 ℃贮藏120.0 h时的热水处理MaHSFA1基因表达量低于对照处理外，其他时段均高于对照处理。

2. 3 热激处理及热激后低温贮藏对MaHSP70基因表达的影响

从图6可以看出，对照处理的MaHSP70基因表达在7 ℃贮藏下呈逐渐下降趋势，且一直维持在较低的表达水平。经热水处理后0.5 h，MaHSP70基因表达量迅速升高至最大值，约是对照处理的4倍，之后逐渐下降。经热水处理的MaHSP70基因表达在7 ℃贮藏下从1.0～4.0 h有微小的增幅，在8.0 h时迅速降低至热处理前的水平。在整个试验过程中，除7 ℃贮藏120.0 h时的热水处理MaHSP70基因表达量与对照处理一致外，其他时段均高于对照处理。

3 讨论

植物HSF分为HSFA、HSFB和HSFC三大类，其中 HSFA1基因在耐热胁迫过程中发挥主要的调节作用，能诱导下游基因如HSP的表达，增强植物耐热性（Liu et al.，2011；Guo et al.，2016）。如大豆GmHSFA1基因过表达能提高植株的耐热性，其原因是激活了热激下游基因如GmHsp70、GmHsp22或其他GmHsps基因的表达（Zhu et al.，2006）。百合组培苗经42 ℃热激处理1.0～12.0 h后，其叶片中的LlHsfA1基因相对表达量总体上呈“上升—下降”交替的变化趋势；且百合叶片LlHsfA1基因在热激处理2.0和9.0 h时分别出现一个表达高峰，表达量约是对照处理的4.3和3.3倍，但整个试验过程中热处理的LlHsfA1基因表达量始终高于对照处理（宫本贺等，2014）。本研究结果表明，MaHSFA1基因表达在热水处理后0.5 h有一个小高峰，且在3.0 h内的表达量一直高于对照处理。目前，有关HSFA1对低温响应的研究很少，本研究发现7 ℃低温能导致MaHSFA1基因表达量下降，但预先经热激处理的MaHSFA1基因表达量在7 ℃贮藏4.0 h后迅速升高至最大值，之后又迅速下降至最低水平。在整个试验过程中，除7 ℃贮藏120.0 h时的热水处理MaHSFA1基因表达量低于对照处理外，其他时段均高于对照处理，说明MaHSFA1基因受低温抑制、受高温诱导增强，热激处理能延缓MaHSFA1基因在7 ℃冷藏中表达量的下降，故推测热激处理诱导香蕉产生的抗冷性与MaHSFA1基因表达增强密切相关。

HSP与热激处理诱导采后果蔬抗冷性的增强密切相关。Sabehat等（1996）研究发现，番茄果实经38 ℃处理48.0 h可提高其在2 ℃贮藏下的抗冷性，且番茄果实的HSP70、HSP18.1和HSP23基因的表达量明显增加，即经热处理诱导产生的热激蛋白能减轻番茄果实冷害的发生。Sevillano等（2010）研究表明，热空气处理（52 ℃，3 min）可减轻番荔枝果实的冷害症状，且果实的sHSP基因表达增加、sHSP活性增强，说明热激蛋白可能参与了热处理诱导的抗冷性。本研究结果表明，未经热水处理的MaHSP70基因表达量在7 ℃贮藏下呈逐渐下降趋势，且一直维持在较低水平；香蕉经热处理0.5 h后其MaHSP70基因表达量迅速升高至最大值，约是未经热处理的4倍，之后逐渐下降。在整个试验过程中，除7 ℃贮藏120.0 h时的热水处理MaHSP70基因表达量与对照处理一致外，其他时段均高于对照处理，说明MaHSP70基因受低温抑制、受高温诱导增强，热激处理诱导MaHSP70基因表达增强可能参与了低温贮藏中香蕉的抗冷性过程。

4 结论

采后香蕉果实的抗冷性与MaHSP70和MaHSFA1基因表达增强密切相关，生产上可通过热处理提高香蕉果实的抗冷性，进而延长贮运期。

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（責任编辑 兰宗宝）