3种东方百合离体培养

闫海霞 蒋月喜 邓杰玲 黄昌艳 王晓国 何荆洲 卜朝阳

摘要：【目的】研究3种东方百合离体培养技术，筛选出适宜其离体培养的统一培养基，为东方百合工厂化育苗提供技术保障。【方法】以3种东方百合提伯、索邦和西伯利亚的鳞片为外植体，筛选适宜的灭菌方法；在MS基本培养基上添加不同种类和不同浓度的激素，筛选适宜的增殖培养基和生根培养基，进一步筛选最适移栽基质。【结果】适宜3种东方百合外植体灭菌的较好方法是：75%酒精灭菌15 s结合升汞灭菌12 min；愈伤诱导和分化的适宜培养基为MS；MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA是增殖培养的最适培养基，提伯、索邦和西伯利亚的增殖系数分别为3.32、3.32和3.00；MS+0.1 mg/L IBA是生根培养的最佳培养基，提伯、索邦和西伯利亚的生根率分别为96.33%、92.67%和93.67%；移栽的最佳基质为泥炭∶珍珠岩（体积比）=2∶1，提伯、索邦和西伯利亚的移栽成活率分别为97.34%、98.00%和100.00%。【结论】建立的3种东方百合离体快繁体系适用于东方百合种球工厂化生产。

关键词： 东方百合；外植体；离体培养；培养基

中图分类号： S682.2 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）06-0889-06

0 引言

【研究意义】百合（Lilium spp.）为百合科（Liliaceae）百合属（Lilium L.）多年生植物。近年来，切花百合在市场上极受欢迎，应用前景广阔，尤其是东方百合在国内外市场的需求量极大。在百合切花生产上，我国商品化种球主要依靠国外进口，存在成本高及携带他国病毒风险高等问题。因此，优化百合种球繁育技术是降低成本、避免他国病毒入侵的有效途径。分球繁殖是百合常用的繁殖方法，但繁殖系数低，且易因病毒等病原积累危害引起种球品质退化等问题，不利于工厂化、规模化生产，而采用离体培养技术可解决此类问题。【前人研究进展】近年来，国内学者对多种百合进行了离体培养研究（黄惠英，2000；何家涛和王会，2007；雷家军等，2008；雷家军和徐莹，2013），成果显著，极受市场欢迎的东方百合离体培养研究也逐渐增多（唐东芹等，2003；庞新霞等，2008；蒲秀琴等，2008；郑洁等，2015）。付文奇等（2008）研究表明，NAA诱导东方百合离体鳞片外植体产生小鳞茎的最佳用量为0.69 mg/L；2，4-D诱导愈伤组织的最佳用量为3.2 mg/L。杨美纯等（2008）以东方百合马可波罗的花被片、花丝、花托、子房为外植体，研究不同激素组合对花器官各部位不定芽诱导率、芽增殖率及生根率的影响，结果表明，花托、花被片、花丝及子房诱导产生丛芽的最佳培养基分别为：MS+6-BA 0.5～3.0 mg/L+ NAA 0.1～0.2 mg/L、MS+ 6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L、MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L和MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；最佳增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；生根结鳞茎的最佳培养基为1/2MS+糖50～80 g/L+NAA 0.4～0.8 mg/L。赵得萍等（2008）以东方百合索邦的花萼、花瓣和花丝为外植体进行花器官诱导能力与再分化能力比较，结果表明，花萼的愈伤诱导率和不定芽再分化率最高，分别为92.0%和89.0%，花瓣次之，花丝最低；花丝分段培养的最佳诱导培养基为MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L，花丝各部位分化能力表现为中部>基部>顶部，中部花丝在MS+NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.2 mg/L培养基上的愈伤诱导率和不定芽再分化率均达100.0%。崔祺和贾桂霞（2014）对东方百合索邦、野生淡黄花百合及新铁炮百合雷山3号的组织培养结果表明，淡黄花百合种子萌发的适宜培养基为MS+0.01 mg/L NAA+60 g/L蔗糖；索邦、雷山3号的不定芽诱导培养基分别为MS+2.0 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA和MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；3种百合的增殖培养基为MS+

2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；适宜索邦无菌苗鳞茎增大的培养基为MS+0.5 g/L活性炭+3.0 mg/L PP333+80 g/L蔗糖。【本研究切入点】目前，东方百合离体培养研究虽然取得了较大进展，报道了许多适宜的培养基配方（刘雅莉等，2004；张延龙等，2004；张艺萍等，2008），但培养基配方各不相同，缺乏统一的适宜培养基配方，结果的重现性差。【拟解决的关键问题】以3种东方百合主栽品种提伯、索邦和西伯利亚为材料进行离体培养研究，筛选出最适合的统一培养基，以解决组培重现性差的问题，为东方百合的大批量快速生产提供技术保障。

1 材料与方法

1. 1 供试材料

供试东方百合品种：提伯（Tiber）、索邦（Sorbonne）、西伯利亚（Siberi）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 外植体灭菌 以自来水冲洗掉百合种球的泥团后剥去最外层鳞片，用中性洗涤剂漂洗5 min，再用流水冲洗30 min，然后转入超净工作台，进行不同灭菌处理方式试验：先用75%酒精灭菌15或30 s，无菌水冲洗3遍，再用0.1% HgCl2灭菌8或12 min，无菌水冲洗3次，将百合鳞片切成小块，然后接种在MS培养基上。每天观察其生长情况，20 d后统计污染及成活情况。培养条件：培养室温度（25±1）℃，光照12～16 h，光照强度1500～2000 lx（以下涉及的組织培养条件均与此相同）。

1. 2. 2 愈伤组织诱导及分化培养 将成活的鳞片接入不添加任何生长激素的MS培养基上，20 d后观察统计愈伤组织诱导及愈伤分化情况。

1. 2. 3 增殖培养 将产生的小鳞茎接入添加不同种类和不同浓度激素组合（0.5 mg/L 6-BA、0～1.0 mg/L NAA和0～1.0 mg/L IBA）的培养基中，20 d后观察统计增殖情况，筛选出最适增殖培养基。

增殖系数=新芽数/接种数

1. 2. 4 生根培养 将生长健壮的植株接入到生根培养基上，生根培养基以1/2MS或MS为基本培养基，附加不同浓度（0.1、0.5 mg/L）IBA，15 d后统计生根情况，筛选出最适生根培养基。

生根率（%）=生根数/接种数×100

1. 2. 5 炼苗移栽 将生根良好的组培苗移出培养室并置于室温下炼苗3 d，然后向瓶内加少许水（以刚没过培养基为宜），继续炼苗1～2 d，小心取出小苗，冼净基部培养基，用多菌灵可湿性粉剂800～1000倍液或0.05%高锰酸钾溶液浸泡10 min，取出在阴凉处晾10～15 min后移栽到3种基质中（表1），浇透水，15 d后统计移栽成活率，筛选出最适移栽基质。

成活率（%）=成活数/移栽数×100

1. 3 统计分析

采用SPSS 16.0对试验所得数据进行统计分析。

2 结果与分析

2. 1 不同灭菌处理方式对东方百合外植体的影响

从表2可以看出，3种东方百合的外植体灭菌效果与酒精及升汞的灭菌时间密切相关。随着酒精灭菌时间的增加，3个品种的污染率虽然有所下降，但成活率也在降低；当酒精灭菌时间为15 s时，随着升汞灭菌时间的增加，3个品种的污染率降低、成活率提高；当酒精灭菌时间为30 s时，随着升汞灭菌时间的增加，污染率虽然为0，但成活率降低；采用75%酒精灭菌15 s结合升汞灭菌12 min的方法，提伯、索邦和西伯利亚的污染率较低，分别为5.56%、9.38%和6.45%，成活率较高，分别达94.44%、90.62%和93.55%；当升汞灭菌时间为8 min时，3个品种的污染率上升、成活率降低；采用75%酒精灭菌30 s结合升汞灭菌12 min时，3个品种的污染率虽然为0，但成活率也降至最低；当升汞灭菌时间为8 min时，3个品种的灭菌效果仍不理想。可见，采用75%酒精灭菌15 s结合升汞灭菌12 min是最适宜的外植体灭菌方法。

2. 3 增殖培养基筛选结果

由表4可知，4种增殖培养基对百合品种不具选择性，均能使3个百合品种发生增殖，但增殖系数各不相同，生长情况也存在差异。其中，在培养基1上，提伯、索邦和西伯利亚的增殖系数分别为3.32、3.32和3.00，均显著高于其他培养基（P<0.05，下同），且植株生长状况好，苗健壮；而在培养基4上，提伯、索邦和西伯利亚的增殖系数均最低，分别为2.12、2.12和2.24，植株长势一般或差，表现为叶片黄化、苗细弱等。综合增殖系数的高低及植株生长情况，3种东方百合增殖培养的最适培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。

2. 4 生根培养基筛选结果

由表5可知，4种生根培养基对百合品种不具选择性，3种东方百合在添加不同浓度IBA的培养基上均可诱导生根，但生根率和植株生长情况不同。其中，培养基1的提伯生根率最高，为96.33%，显著高于除培养基3外的其他培养基，且植株长势好，根系粗壮，长约2.0 cm；培养基3的生根率次之，为92.00%，与其他3个培养基的差异不显著（P>0.05，下同），植株长势好，长约1.0 cm。不同培养基处理索邦和西伯利亚生根率无显著差异，但均以培养基1的生根率最高，分別为92.67%和93.67%，植株根系均较粗壮。从表5还可以看出，在同一品种中，当IBA浓度一致时，随着大量元素和蔗糖添加量的减少，其生根率也随之降低。可见，大量元素和蔗糖对3种东方百合的生根培养有较大影响。综合植株生根率的高低及植株生长、生根情况，3种东方百合的适宜生根培养基为MS+0.1 mg/L IBA。

2. 5 炼苗移栽基质筛选结果

由表6可知，3种基质对百合品种不具选择性，3种东方百合移栽在不同的基质上均可成活，但不同基质下植株的成活率不同。提伯、索邦和西伯利亚在基质1中的移栽成活率均最高，分别为97.34%、98.00%和100.00%，均显著高于基质3，但与基质2的差异不显著，此时百合植株健壮，长势旺盛；采用基质2时，3个品种的移栽成活率均有下降，且植株长势缓慢；采用基质3时，3个品种的植株长势均较差，移栽成活率也明显降低，分别为83.34%、80.66%和82.66%。可见，最适合3种东方百合移栽的基质为泥炭∶珍珠岩=2∶1。

3 讨论

本研究外植体采用75%酒精灭菌15 s结合0.1% HgCl2灭菌12 min，可确保较高的成活率和较低的污染率，提伯、索邦和西伯利亚的污染率分别为5.56%、9.38%和6.45%，成活率分别达94.44%、90.62%和93.55%，与前人的研究结果（雷家军等，2008；付娜等，2010）较接近。雷家军等（2008）研究表明，百合鳞片的最佳灭菌方法是0.1% HgCl2灭菌8 min，污染率较低，为11.0%，而成活率最高可达88.0%；付娜等（2010）采用75%酒精浸泡20 s后用0.1%升汞灭菌12 min处理龙牙百合珠芽的效果最好，外植体污染率较低，成活率较高。从本研究结果可知，外植体灭菌效果受酒精灭菌时间影响较大，随着酒精灭菌时间的增加污染率虽然有所下降，但成活率也随之降低，主要原因在于酒精浸泡时间过长，其较强的穿透力不但使菌体蛋白质变性，而且使植物蛋白发生不可逆的变性而死亡，导致外植体成活率降低。但也有较长时间的酒精灭菌结合较长时间的HgCl2灭菌方法，如何林（2007）采用75%酒精灭菌90 s、0.1%升汞灭菌13 min处理百合鳞片外植体，可把污染率降低到10%，并获得83.3%的诱导率。产生此差异的原因可能与所取材料成熟度、部位或材料自身的差异等有关。可见，外植体的灭菌时间需控制在一个合适的范围内才能获得较好的灭菌效果。

随着切花百合在市场的走俏，其需求量越来越大，对百合种球的需求也逐渐增加，使种球繁育面临严峻的形势和压力，而筛选出适宜的培养基可有效缓解种苗繁育压力。目前百合的组培快繁存在重现性差的问题，即不同研究所报道的适宜培养基配方不同。如针对提伯，不同研究的适宜增殖培养基不同，有MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA（何林，2007）或MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA（卢赛清，2007）；索邦的最佳增殖培养基有MS+l.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA（何林，2007）或MS+0.4 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA（卢赛清，2007）。产生这种差异的原因：一是外植体个体本身存在差异；二是培养基的差异，由于药品的出厂批次或培养基制成的精确度不同所造成差异；三是由于不同地域培养的环境条件不同而产生的差异等。本研究通过多次试验，筛选出适合3种东方百合离体培养的统一培养基，为东方百合种苗的工厂化生产提供了技术保障。

4 结论

本研究结果表明，适合3种东方百合离体培养的外植体灭菌消毒最适方法为：75%酒精灭菌15 s结合升汞灭菌12 min；愈伤诱导和分化的适宜培养基为MS；增殖培养的最适培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；生根的最适培养基为MS+0.1 mg/L IBA；移栽最佳基质为泥炭∶珍珠岩（体积比）=2∶1。本研究建立的离体快繁技术体系适用于东方百合种球工厂化生产。

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（责任编辑 邓慧灵）