油梨组织培养研究进展

罗小燕 申志力 李娟 陈杰忠 赵春香

摘 要 介绍油梨组织培养的国内外研究现状，包括油梨组织培养的茎尖培养、胚培养、愈伤组织培养和原生质体培养等方法，总结油梨组织培养的条件和目前存在的问题，并提出今后的展望。

关键词 油梨；组织培养；研究进展

中图分类号 S667.9 文献标识码 A

Abstract The advance of avocado tissue culture was introduced， including stem tip culture， embryo culture，callus culture and protoplast culture. Culture conditions and main problems in avocado tissue culture were summarized and the development direction in the future was stated.

Key words Avocado； Tissue culture； Research progress

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.030

油梨（Persea americana Mill.）又称牛油果、樟梨、鳄梨属于樟科热带、亚热带常绿乔木，是世界上热带亚热带著名的水果之一[1]。油梨原产于中美洲及墨西哥湿润地区，根据其生长的环境，油梨主要分为3个品种群：墨西哥系、西印度系和危地马拉系[2-7]。而‘Hass油梨品种是目前世界上种植最广的商业品种，因其稳产、高产、质优而受到栽培者和消费者的欢迎[8]，且以其为主要研究材料进行的相关研究较多[8-12]。油梨营养丰富，富含维生素、蛋白质、脂肪，以及富含钙、镁、钠等矿质元素；并且对人体具有医疗保健作用[13-15]。其种子也富含维生素、蛋白质、脂肪，钠、钾等矿质元素；有较高利用价值[16-17]。

近年来我国从国外引进不少油梨品种[10，18]，油梨产业的发展可丰富我国的水果供应。油梨传统的繁殖方式是实生苗繁殖，而油梨果实单一种子，多胚率不高，繁殖材料难得，繁殖系数低，幼苗生长期长，育苗耗时[19-20]，限制了油梨的种植和产业发展。

油梨的种植和产业发展也受病害等因素的影响，如根腐病、炭疽病、日斑病等[21-23]。在自然界中，很多植物受病害侵染而引起病害，造成生长不良，轻则减产或产品质量下降，重则造成毁种绝收。在生产上很多果树都是利用嫁接、分株和扦插等无性繁殖来育苗，这些繁殖体会将已经感染的病毒传染给后代，代代相传，长期积累，复合感染。而茎尖分生组织培养或者热处理结合的茎尖培养是脱病毒的主要技术，以组织培养技术为基础的离体快速繁殖是应用最广和最有效的一种育苗技术。

植物组织培养是利用植物细胞具有全能性，在无菌的条件下，把离体的植物器官诱导产生愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整植株的一种技术。油梨组织培养技术具有增殖倍数大，培养周期短，繁殖快，可脱除病毒，经济效益好等优点；近年来发展很快[24]。笔者对近年来国内外研究学者在油梨组织培养方面的研究成果，对油梨的无性系繁殖、无病害苗木培育、种质资源保存和生理生化等方面的研究方法和技术进行了总结，以期为该领域今后的研究提供参考。

1 油梨外植体组织培养

油梨组织培养技术所使用的外植体包括茎段（带顶芽和腋芽）、合子胚和原生质体等。根据所使用的外植体和培养途径，油梨组织培养技术可归类为茎尖培养、胚培养、原生质体培养和愈伤组织诱导等。

1.1 茎尖培养

利用茎尖作为外植体进行组织培养是油梨无病毒苗的培育方法之一，可以快速繁殖大量的优良苗木[25]。离体条件下木本植物不定芽的诱导主要受到基因型、外植体来源和培养基中不同激素配比的影响[25]。木本果树的老熟枝条作外植体通常携带病菌较多，初分化和再分化难，严重影响组织培养的成功率；因而，油梨茎尖培养多以成年油梨树的半木质化嫩枝条或幼胚苗的茎尖作为外植体进行培养。

Schaffer等[26]认为利用幼嫩茎段为外植体进行培养时N元素的形式和浓度对其诱导和增殖效果影响显著；同时指出培养环境中CO2的浓度对其有一定影响。梁日高等[27]利用7年生的油梨茎段为外植体发现最适宜的诱导培养基为1/2 MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+30 g/L白糖+6 g/L卡拉胶（kappa-Carrageenan）（1/2 MS指MS培养基中的大量元素减半），最适宜的增殖培养基是MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+30 g/L白糖+6 g/L卡拉胶；最适宜的生根培养基是1/2 MS+IBA 1.0 mg/L+30 g/L白糖+6 g/L卡拉胶（1/2 MS指MS培养基中的大量元素减半）。且指出可用自来水代替无菌水，白砂糖代替分析纯蔗糖，卡拉胶代替琼脂粉。Barrera-Guerra等[28]利用嫩枝的茎段和幼苗的茎段段作为外植体在MS培养基中进行诱导、增殖和生根培养；并且在培养基中添加四环素（Tetracyclines）、庆大霉素（Gentamicin）、利福平（Rifampicin）等抗生素以更加彻底地灭菌和减少污染，结果发现油梨茎尖培养的周期更长，生根率更低。Vega[29]认为西印度系的the‘Colin V-33油梨品种的茎尖培养诱导率成功较高，并且提出6-BA和GA3对茎尖培养影响较大。一般认为，采用不同部位（上、中、下）的茎段作外植体时其诱导率不同，如以‘Nauclea diderrichii幼苗枝条上端的茎段为外植体时其诱导效果最佳[30]；而针对油梨不同部位茎段诱导效果则有待做进一步的探讨。

许多研究表明利用油梨茎段为外植体， 其污染率较大， 原因主要是难以获得无菌外植体。而利用油梨实生幼胚苗的茎段，生长势较旺盛，带菌较少，是油梨茎尖组织培养的优良材料。

1.2 胚培养

油梨果实具单一种子，多胚率不高，合子胚（由植物的雌雄配子融合形成的合子继而发育形成的有性胚）往往只有一个。在油梨果实的整个发育过程中其幼果不断脱落，果实接近成熟时其种胚才能存活；若不采取种胚离体培养，就会降低油梨育种工作的效率[31]。油梨种胚组织培养分为未成熟胚和成熟胚组织培养。油梨种胚培养有助于克服杂交育种中合子胚退化或败育性等问题，种胚培养技术的发展推动油梨育种工作的进行。目前较多的报道是利用未成熟的合子胚作为外植体，通过合子胚的早期离体培养能够获得杂种后代；在油梨优良种质保存以及防止种质退化等方面有较大的应用价值[32]。较多的学者利用合子胚为外植体进行油梨完整植株诱导，并结合离体低温保存技术进行种质保存技术研究。

一般认为胚龄是影响油梨幼胚培养成功的关键因素之一。Sken等[31]利用不同胚龄的油梨种胚作为外植体，研究发现油梨极幼小的种胚在各种的培养基中基本不能生长，在培养基中添加生长调节剂效果不明显；只有6～7周龄或以上的胚才能大量存活且在培养基中添加植物生长调节剂其生长速度加快。Rohim等[11]以‘Hass油梨品种种胚为外植体，发现胚龄是影响胚培养的重要因素，胚龄越小其诱导率越低；胚龄在180～210 d的合子胚诱导率达100%。因为油梨极幼小的种胚在各种培养基中基本不能生长，只有6～7周龄或以上的胚才能大量存活。利用油梨未成熟合子胚来诱导形成体细胞胚胎并在合适的条件下进行“胚性生长”，从而进行正常的胚胎发育并完成其胚胎发育过程后诱导形成苗[33-34]。一般，油梨合子胚培养较多采用MS（Murashige Skoog）培养基，也有研究者采用B5、1/2 MS等培养基。由于幼胚生长在一个高渗透压环境下，离体培养时需要高盐浓度培养基；需要增加蔗糖的浓度[35]。为了探讨蔗糖浓度、凝胶剂浓度和培养基类型等对油梨幼胚培养的影响，Witjaksono Litz等[36]利用油梨未成熟合子胚为外植体，发现在MS培养基中培养效果最佳，且添加6～7 g/L凝胶剂和30 g/L蔗糖效果最佳。同时，在油梨胚培养中为改善其生长环境除了使用蔗糖外，也有采用脯氨酸（Proline）、谷氨酸盐（Glutamic acid）等作氮源以增加培养基的铵态氮浓度。Encina等[37]应用二步培养法（在固体、液体培养基交替培养）进行胚培养，添加脯氨酸和谷氨酸盐改善其诱导效果。Raharjo等[20]利用‘Hass油梨品种未成熟合子胚作外植体，其研究发现在体细胞胚胎诱导和增殖培养阶段添加肌醇（Inositol）、毒秀锭（Picloram）和硫胺素盐酸（Thiamine hydrochloride）等物质有利于促进培养物的生长。

温度和光照条件也是影响胚培养的因素之一，不同果树品种对温光的要求各不相同。对于油梨种胚组织培养较多的研究学者认为（25±1）℃较合适[34，36-39]，也有人认为在27 ℃较适宜[20]。在油梨合子胚培养过程中有的采用光培养，有的采用暗培养，也有人进行光暗交替培养。Márquez-Martín等[38]利用光暗交替培养技术提高油梨合子胚诱导率。

油梨合子胚培养利于克服胚退化和种胚败育性等问题，提高育种工作的效率。但油梨合子胚培养，会出现单极生长（只有茎段生长或根生长），顶端或节点容易坏死等现象[40]。油梨胚胎培养物会随着时间的延长和形态的改变失去其胚胎的完整性；依据品种的不同，一般在诱导培养3个月之后出现此现象[34]。出现两极生长（茎段和根正常生长）现象的概率大概是0.002%～5%或6%，其概率的大小依品种而异[41]。为解决这一问题Raharjo[11]结合微芽嫁接技术培育完整油梨植株，以‘Hass、‘Booth-7、‘Lima Late、‘Lula和‘Waldin4个品种的油梨未成熟合子胚培养发育形成的茎段或由茎尖诱导培养形成的茎段为接穗，以‘Bernecker油梨品种实生苗为砧木进行嫁接。发现嫁接后的成活率达59%～100%，顶端嫁接和腹嫁接的成活率达68%～72%；且在嫁接后20～25 d开始生长，其成活率可达52%～76%。

油梨种胚培养技术有利于培育无病毒苗木，Sánchez-Romero等[42]提倡油梨育种工作中应广泛使用合子胚诱导技术；因为未成熟油梨种胚是优良的外植体，因其污染率较小、取材较方便和诱导成功率较大。不同油梨品种发育程度不同的合子胚，对培养条件的要求不同，这有待研究者进一步探讨。

1.3 愈伤组织培养

为了获得最佳的油梨组培材料，有人利用茎段或叶子为外植体并结合愈伤组织诱导技术来培育完整的油梨植株。Young等[43]利用‘Lula和‘Waldin油梨品种实生苗的叶子、腋芽和茎段作为外植体来诱导愈伤组织。发现油梨叶片的存活率和愈伤组织的诱导率可通过选择适当部位的外植体和调整其在培养基中的放置位置来优化， 合适的培养温度和适当使用生长激素可增强愈伤组织的诱导；适当使用GA3和提高培养的温度可促进腋芽的伸长。在光照条件下和使用1.0 mg/L BA可以促进愈伤组织分化出芽；但是，利用油梨叶片诱导愈伤组织时间周期长，成功诱导率也较低，而利用接近叶腋部位的叶柄和带腋芽的茎段效果较好。

彭民璋等[44]以‘Hass油梨品种的种胚为外植体，诱导形成愈伤组织作为保存材料并研究采用冷藏（8 ℃）、利用多效唑延长继代时间、减少继代次数等方法；发现低温（8 ℃）保存，贮存时间长约6个月时愈伤组织依然具有再分化能力。用0.4 mg/L多效唑对油梨愈伤组织进行处理，愈伤组织保存8个月后依然具有较强的脱氢酶活性和较高的植株再生频率。Guzma′n-Garc1′a等[45]使用缓慢冷却法和熔滴玻璃化法，发现用熔滴玻璃化法处理60 min油梨种胚的再生恢复能力可达77.78%～100%；同时指出原始材料是种质离体低温保存的关键且胚性愈伤组织和体细胞胚在融化之后依然会保持较高的再生能力。进行离体低温种质保存的好处在于：（1）利于保存从作物改良研究中发现的优良胚系，（2）备份异地种质库[41]。在国内外曾有研究者利用离体低温保存技术解决此问题， 油梨种质离体低温保存对于油梨种质的保存和培育优良品系种群具有重要作用。此外，研究油梨种质离体低温保存技术，有利于发展培育优良无病害的植株建立优质油梨种质资源库。

1.4 原生质体培养

在国外利用油梨原生质体作为外植体诱导，培育油梨完整植株也有相关报道。植物原生质体在适宜的条件下具有再生成与其亲本相近个体的全能性，可经离体培养得到再生植株。借助原生质体培养及诱导融合技术可获得杂种和多倍体植株， 可有效克服植物有性杂交不亲和现象；利于提高果实产量，改善果实品质，培育新品种[46]。

原生质体再生实验已在芸香科[47]和蔷薇科的苹果[48]、酸樱桃[49]和梨子[50]得到应用。利用油梨未成熟合子胚进行原生质体的分离和培养也有报道。Grosser等[51]利用‘T362油梨品种未成熟合子胚和珠心胚作为外植体通过原生质体分离提纯、培养、诱导愈伤和再生植株；发现培养基类型、培养基浓度、培植的密度等对原生质体培养影响显著，以MS培养基效果较好。研究认为影响原生质体培养的因素主要有植物基因型、原生质体的栽植密度、培养基类型和激素等[46]。

原生质体培养技术要求较高，难度大，而且在我国油梨原生质体培养少有报道。目前还需要经过探索和研究，进一步形成和完善适合不同油梨基因型的高效培养体系，以缩短原生质体培养的周期和促进育种工作的进行。

1.5 培养条件和培养基

油梨组织培养过程中，温度、光照和pH等环境因子对组织培养有显著影响。研究认为，油梨组织培养的最佳温度为（25±1）℃，光照强度为2 000～3 000 lx，光照时数为10～16 h/d，pH为5.7～6.0，蔗糖的浓度为25～45 g/L，以30 g/L效果最佳，凝胶剂多使用琼脂粉[11，20，26-30，34，36-39，44，4，52-53]。但是，Raharjo等[20]把油梨组织培养物放于（27±1）℃环境下，发现培养效果更好。Pitekelabou等[30]认为把培养物置于（27±2）℃环境下，培养效果也较好。

培养基类型也是油梨组织培养的重要影响因子之一，大部分学者以MS、1/2 MS和B5为基本培养基[27-28]；也有人以WPM、改良MS（大量元素减半）为基本培养基[27，30]。为探讨培养基类型对组织培养的影响，Rohim等[11]以‘Hass油梨品种合子胚为外植体，以MS和B5为基本培养基，发现MS培养基培养效果最佳。总的来说，在油梨组织培养中，供试品种及其外植体类型不同，不同的培养基类型和培养条件产生的影响不同，效果最佳的为MS培养基。

2 存在的问题

2.1 污染

组织培养过程中造成的污染可分为外源性污染和内源性污染， 外源性污染只要操作严格要求，环境条件严格控制，一般可以控制；而内源性污染是最难控制的污染源，主要从外植体的选取以及外植体的消毒等方面控制[54]。同时，造成污染的病原主要分为细菌和真菌，细菌污染在接种1～3 d后就可被发现；真菌污染的特点是污染部分长有不同颜色的霉菌，在接种3～15 d后才可被发现[55]，在接种后两周左右才可判断外植体能否正常生长；而常用的消毒剂有次氯酸钠、漂白水、氯化汞[56]。

若污染菌类是从材料周围长起，则可判定为植物材料自身带菌引起；也有可能是接种时材料被污染，接种工具灭菌不彻底导致。如果污染菌类是从培养基以上部分长起，不是在培养基长起，同时在接种5 d后发现，就可判定污染是油梨外植体本身的内生菌导致。如果污染菌类是零星分散于培养基中，就可确定为人为造成的污染；比如接种用具、培养基灭菌不彻底，接种员操作不正确，开瓶时间太长，操作中心在人体范围内；培养室环境不干净等。如果污染是从培养基以下部分开始生长， 且有从里向外发展的趋势， 就说明是切口引起的污染，原因可能是外植体灭菌之后没有剪去切口；或虽剪去，但器具本身带菌[56]。

为减少油梨组织培养过程中产生的污染，一般采用污染较少且生长旺盛的植物部位作为外植体，很多学者采用未成熟的合子胚、幼胚芽等为外植体[11，20，26-30，33-34，36-40，53]。Barrera-Guerra等[28]利用嫩枝茎段和幼胚芽为外植体，并提出在培养基中添加四环素、庆大霉素、利福平等抗生素可减少污染。值得注意的是使用抗生素虽有一定的杀菌效果，但是并不是对每一种菌种都有效[56]。同时抗生素在不稳定的环境下易分解而失去其活性，而且使用浓度不对也会对外植体产生负面影响；因此寻找适宜的抗生素已成为重要的课题。

针对不同污染情况有不同的解决方法，主要采取4个方面的措施：一是外植体的选择，选择带菌少的外植体。二是选择适当的消毒方法，常见的消毒剂有次氯酸钠、乙醇、氯化汞、过氧化氢等。三是对接种室进行空间灭毒。最后是操作人员严格按照无菌操作规则进行操作。

2.2 褐化

油梨为木本植物，次生代谢旺盛，植物体内含有较多的酚类和醌类化合物，这些褐色物质在培养基中不断扩散积累，抑制其他酶类的活性，毒害培养材料，严重地影响整个组织培养过程。实验研究认为，外植体的生理状态和部位、取材时间和大小、受伤程度及所用消毒剂等对褐化有一定程度的影响[57]。谢志亮等[58]指出外植体材料（包括外植体取材时间、外植体大小、外植体部位和种类、外植体消毒时间等）、培养基和培养条件对褐化有一定影响；同时，可通过选择适宜的外植体、预处理材料、选用适宜的培养基和培养条件、使用防褐剂和连续转移外植体来减少褐化。在油梨组织培养中常用的方法是在培养基中添加防褐化剂如活性炭、硝酸银、PVPP（Crosslinking polyvingypyrrolidone）和维生素C（Vitamin C）[59-60]。Encina等[37]以活性炭为添加剂，使得外植体生长状态更佳，褐化率减少。使用活性炭在一定程度上可减少褐化，但使用时要注意控制浓度和使用的时间，否则会对外植体产生不良效果。

虽然一定浓度的防褐化剂可在一定程度上减轻褐化对培养物的影响，但对于一些褐化严重的植物则效果不明显。所以，要从根本上解决此问题就要从褐化产生的生理及分子机理深入探讨。

2.3 组培苗生根难度大

组培苗的生根过程是一个复杂的生理生化过程， 一般影响外植体不定根的因素主要有外植体基因型、培养基类型、取材部位、植物生长调节剂、培养条件等[61]。油梨组培苗生根难度大主要表现在生根概率低，一些品种难以获得完整植株，出现单极生长现象。

油梨合子胚培养再生繁殖形成两极生长的完整植株的概率大概是0.002%～6%，其概率大小依品种而异[52]。Barrera-Guerra等[28]利用茎段为外植体培养在生根阶段尝试了各种处理，发现其生根的概率为0～20%。Encina等[37]为解决此问题尝试二步培养法（固态培养基-液态培养基-固态培养基）使得生根率增加到35%～58.3%。油梨是木本植物，其在组培过程中生根较困难，可通过使用不同浓度的IBA和体外微芽嫁接来促进生根，同时注意观察幼苗的生长情况，Barrera-Guerra等[28]，在外植体培养期间，发现根的形成和生长较难且嫩枝生长较慢。Raharjo等[52]结合微芽嫁接技术来培育完整油梨植株，以组培苗的茎段为接穗，以油梨幼苗为砧木；结果形成完整植株且成活的概率达52%～76%。

油梨生根培养存在一定的难度， 同时也是整个组织培养过程成功的关键部分之一。因此，诱导带有高质量根系的组培苗是亟待解决的问题。

2.4 移栽成活率不稳定

油梨组培苗移栽成活率不高，一是组培苗移栽阶段感病严重而加大死亡率，二是组培苗在移栽过程中易断根。因此，要提高不定根质量和组培苗适应环境的能力，提高移栽成活率，才能为实现油梨产业化发展奠定基础。Martínez-Ferri等[62]在油梨植物生产育苗阶段引入菌根剂和施加鸡粪，发现对油梨植株的生长有积极影响。为提高油梨组培苗的移栽成活率，在移栽前可对组培苗进行炼苗和优化移栽基质；同时密切观察组培苗的长势。

3 展望

植物组织培养技术的发展在生物科学研究和应用中发挥重要作用，也在油梨的栽培与生产上得到广泛的应用与研究。通过茎尖培养繁殖无病毒植株，利用胚培养诱导未成熟种胚的发育与成长；借助离体低温冷冻保存技术保存优良油梨种质和选择优质油梨品种。油梨离体培养技术的迅速发展和不断完善，将会大大提高油梨的育种效率，加快油梨品种改良和油梨产业化的进程。

针对油梨组织培养存在的问题，目前我国学者研究甚少，为此我国的研究学者应加大力度重视油梨组织培养的技术研究体系；形成针对不同品种的实用、高效、标准的组培快繁体系。结合基因工程技术培育高产、优质、营养价值高、无病害、树体矮化、树形优美的油梨新品种；满足人民日益增长的需求。

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