龙眼多糖树脂脱色除蛋白工艺优化

蓝海波 温亚洲 杨光美 李武

摘 要 评价了7种树脂对龙眼多糖脱色除蛋白的效果和多糖保留率的影响，筛选弱碱性离子大孔树脂D301-R为最优树脂用于后续实验。采用单因素和Box-Behnken Design响应面试验对D301-R脱色除蛋白工艺条件进行优化。确定其最佳工艺条件为：树脂用量0.61 g/mL，温度48 ℃，pH5.0，时间2.0 h。在此工艺条件下，其脱色率为75.32%，蛋白去除率为91.83%，多糖保留率为93.37%。

关键词 龙眼；多糖；大孔树脂；脱色除蛋白；工艺优化

中图分类号 R284 文献标识码 A

Abstract The effects of seven resins on the deproteination and decolorization in purifying longan polysaccharide were studied. The results showed that D301-R was better than the other six resins in protein and color removal. Deproteination and decolorization experiments were carried out by single experiments and the Box-Behnken response surface methodology（RSM）experiment. The optimum technological conditions are as follows： liquid/solid ratio 0.61 g/mL， temperature 48 ℃， pH5.0 and time 2.0 h. Under the conditions the polysaccharide retention， the decolorization rate and the deproteinization rate was 93.37%， 75.32% and 91.83%， respectively.

Key words Longan； Polysaccharides； Macroporous resin； Decoloration and deproteinization； Optimization

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.019

龙眼（Dimocarpus longan Lour.）是我国南方特色水果，其营养丰富，具有良好的保健功效[1]。现代研究发现，龙眼多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、保护肝脏等多种活性作用[2]。

龙眼果肉含糖量高，不同品种和产地的龙眼干肉多糖含量在16%～25%之间[3-4]。龙眼经提取获得的粗多糖除含有糖类物质外，还含有少量的蛋白质和色素等杂质。目前通常采用Sevag法或TCA法对多糖中的蛋白质进行去除[5]，再通过活性炭吸附、H2O2脱色和透析等方法除去其中的色素等杂质[6]。这些脱色除蛋白的方法操作较为繁琐、多糖损失量大，且不适宜食品级多糖的生产。

大孔树脂是一类具有多孔骨架结构的交联聚合物，可以通过吸附或离子交换作用对有机物进行分离、除杂和浓缩[7]。大孔树脂已被应用于木糖等单糖的生产纯化过程[8-9]。冯思欣等[10]采用D152树脂对板蓝根多糖进行脱色，获得了较高的多糖保留率（95%）。王雪艳[11]比较了5种大孔树脂和双氧水、活性炭对龙眼多糖的脱色效果，发现大孔树脂XDA-1对龙眼多糖脱色效果较好，但其多糖保留率较低（81.55%），且未对其蛋白去除效果进行评价。易阳等[12]采用大孔树脂对龙眼多糖进行脱色除蛋白，取得了较好的效果，其多糖保留率达到85%。本研究通过大孔树脂的筛选，确定龙眼多糖脱色除蛋白的理想树脂，并采用响应面试验优化确定其最佳脱色除蛋白工艺条件，旨在为龙眼多糖的研究及工业化生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 龙眼干，经鲜龙眼（品种“储良”）去皮、去核65 ℃鼓风干燥制得，其含水量为11.4%。

大孔弱碱性离子交换树脂（D301-R、D296）、大孔强酸性离子交换树脂（D001×7）、大孔强碱性离子交换树脂（D280）、大孔吸附树脂（D3520、NKA-9、HPD-100）购自南开大学树脂有限公司。其他常规试剂为国产分析纯。

1.1.2 仪器与设备 RHBASIC-II型磁力搅拌器，德国IKA公司；FSH-2A型打浆机，金坛市水北康辉实验仪器厂；SHZ-A水浴震荡器，金坛市城西春兰实验仪器厂；2550紫外可见分光光度计，日本岛津公司；R502B型旋转蒸发仪，上海申生仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多糖的提取 采用热水浸提法：龙眼干60 ℃热水浸泡20 min后打浆，料液比1 ∶ 30，80 ℃水浴浸提2.0 h，200目纱布过滤，20倍浓缩，离心（5 000 ×g；15 min）去沉淀，得龙眼粗多糖溶液。

1.2.2 分析方法 多糖保留率的测定：总糖测定采用苯酚硫酸法[13]。还原糖测定采用3，5二硝基水杨酸法[14]。多糖含量=总糖含量-还原糖含量。多糖保留率=（MHZ-MHH）/（MQZ-MQH）×100%，式中MQZ和MHZ分别为吸附前后的总糖总量，MQH和MHH分别为吸附前后提取液中还原糖总量。

蛋白去除率的测定：蛋白质含量采用考马斯亮兰法测定[15]。蛋白去除率=（M′Q-M′H）/M′Q×100%，式中M′Q和M′H分别为吸附前后的蛋白质含量。

脱色率测定：多糖溶液调节至pH（6.5±0.1），8 000 ×g离心15 min后过滤，420 nm处测定OD值。脱色率=（OD前-OD后）/OD前×100%，式中OD前和OD后分别为脱色前后溶液的光密度值。

1.2.3 大孔树脂脱色除蛋白效果评价 分别对大孔树脂吸附前后的脱色率、多糖保留率、蛋白去除率3项指标进行加权求和，其权重系数分别为0.3、0.4和0.3。依据公式：u=0.3x+0.4y+0.3z计算评分。

式中x表示脱色率（%），y为多糖保留率（%），z为蛋白质去除率（%）。

1.2.4 大孔树脂的筛选 分别精密称取20.0 g树脂于100 mL三角瓶中，加入粗多糖溶液40 mL，于40 ℃，120 r/min 摇床中吸附2.0 h，200目纱布过滤并用蒸馏水洗涤树脂，合并滤液，定容至50 mL，分别测定吸附后的多糖保留率、脱色率和蛋白质去除率，参照1.2.3对大孔树脂脱色除蛋白效果进行评分。

1.2.5 单因素实验 考察了树脂用量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL）、吸附温度（30、40、50、60、70 ℃）、吸附时间（1.0、2.0、3.0、4.0 h）及pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）对树脂脱色除蛋白效果的影响。

1.2.6 响应面优化 依据单因素试验结果，应用Design-Expert 8.0软件，设计Box-Behnken Design响应面试验，利用响应面试验结果，确定树脂最佳吸附条件。响应面试验因素水平设定见表1。

1.3 数据处理

树脂筛选及单因素试验显著性分析均采用SPSS11.5软件进行。响应面试验中方差分析采用Design-Expert 8.0软件进行。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的筛选

龙眼多糖提取液中的色素与蛋白质是其多糖分离纯化过程中的主要杂质，色素与蛋白质的含量过高，会降低多糖在下一步凝胶色谱分离纯化的效果。由表2可知，树脂D301-R、D001×7和D280的脱色效果明显优于其他4种树脂（p<0.05）。在蛋白质去除方面，D280（38.61%）和HPD-100A（36.73%）的去除率较低，D001×7、D3520、D296、NKA-9树脂的蛋白去除率在60%左右，D301-R的蛋白质去除率最高，为75.56%（p<0.05），且其多糖保留率也相对较高（86.74%）。

综合上述实验结果，筛选确定D301-R为龙眼粗多糖提取液脱色除蛋白的最优树脂，进行后续单因素与响应面优化实验。

2.2 单因素实验

2.2.1 吸附时间对脱色除蛋白效果的影响 从图1可见，吸附时间在1.0～4.0 h时，随着吸附时间的延长，脱色率和多糖保留率逐渐升高，但是多糖保留率逐步下降。当时间大于2.0 h后，树脂对色素和蛋白质的去除效果不再显著增加，但对多糖的吸附明显增多。综合上述因素，确定D301-R脱色除蛋白的吸附时间为2.0 h。

2.2.2 pH值对脱色除蛋白效果的影响 从图2可见，多糖溶液的pH值能影响树脂对蛋白质和色素的吸附，在pH3.0～7.0范围内，随着pH值的降低蛋白去除率和脱色率逐渐升高，但是较低pH值会导致多糖降解，导致多糖保留率降低。综合上述因素，确定D301-R脱色除蛋白的pH值为5.0。

2.2.3 树脂用量对脱色除蛋白效果的影响 从图3可见，在一定范围内，蛋白去除率和脱色率随树脂用量的增加而提高。当树脂用量超过0.6 g/mL时，蛋白质和色素的去除率不再显著提高，反而会增加多糖的吸附。综合实验结果，确定树脂的用量为0.6 g/mL。

2.2.4 温度对脱色除蛋白效果的影响 从图4可见，吸附温度在30～70 ℃时，随着吸附温度的升高，多糖保留率和蛋白去除率升高，当温度高于50 ℃时其蛋白去除率不再显著增加。脱色率随温度的升高呈现先升高后降低的趋势，当温度大于50 ℃时，树脂对色素的吸附效果下降，综合以上因素，确定D301-R脱色除蛋白温度为50 ℃。

2.3 响应面优化

2.3.1 Box-Benhnken中心组合试验结果与分析

通过响应面法对温度、pH值和树脂用量3个因素分析得到以下实验方案及结果（见表3）。

2.3.2 回归模型的建立与分析 利用Design-Expert 8.0 软件对2.3.1实验结果进行多元回归拟合，得到x（脱色率）、y（多糖保留率）、z（蛋白去除率）为响应值的回归方程：

x=75.56+1.19A-0.16B+0.31C-0.020AB+0.038AC-0.095BC-6.42A2-2.99B2-1.85C2

y=93.51-2.13A-0.13B-0.49C-0.36AB-0.003AC+0.11BC-1.92A2-2.52B2-1.11C2

z=91.55+0.78A-0.25B+0.41C-0.68AB-0.49AC-1.24BC-2.01A2-2.02B2-2.06C2

上述回归方程的方差分析如表4所示，由表中ANOVA分析结果可知，3个模型的p<0.001（极显著），失拟项p>0.05（不显著），表明方程拟合性好，实验误差小。模型x，y，z的相关系数R2分别为0.998 3、0.993 3和0.995 4，表明模型的线性较好。x模型的AdjR2=0.996 1，表明该模型拟合度较好，0.35%的变异系数（CV）表明该模型重现性好。y和z模型中，变异系数分别为0.5%和1.1%，表明这2个模型拟合度和重现性好。

综合以上分析，表明3个模型拟合度和重现性较好，可以较好的反映D301-R树脂吸附因素与多糖保留率和脱色除蛋白效果的关系。

从各因素的显著性水平可知，对脱色率的影响次序分别为：温度>pH值>树脂用量；对多糖保留率的影响次序为：温度>树脂用量>pH值，3个因素均显著（p<0.05）影响蛋白保留率。3个因素的二次项A2、B2和C2对脱色率、多糖保留率和蛋白去除率均有显著影响（p<0.001）。温度和pH值的交互项AB显著影响多糖保留率（p<0.05）和蛋白去除率（p<0.001），对脱色率无显著影响（p>0.05）。树脂用量与温度和pH值的交互项AC、BC对蛋白去除率的影响显著（p<0.01），对脱色率和蛋白去除率无显著影响（p>0.05）。

2.3.3 交互作用响应面分析

（1）脱色率交互作用响应面分析。由温度和pH值对脱色率影响的分析（图5）可以看出响应面比较陡峭，等高线接近圆形，表明温度和pH值对脱色率的影响显著，它们的交互作用不显著。图6温度和树脂用量对脱色率的影响显著，二者的交互作用显著。当温度在48～52 ℃之间时，脱色率随着树脂用量的变化显著提高，能达到最大值。图7可以看出pH值和树脂用量对脱色率影响不显著，二者交互作用不显著。

（2）多糖保留率交互作用响应面分析。由图8可以看出，温度和pH值对多糖保留率有显著影响，温度在45 ℃左右时，多糖保留率能够达到最大值。由等高线可以看出，二者的交互作用不显著，pH值在4.5～5.5，温度在45 ℃左右时多糖保留率较高，能达到最大值。由图9可以看出温度和树脂用量对多糖保留率影响不显著，较低温度可以减少树脂对多糖的吸附，达到较高的多糖保留率，二者交互作用不显著。由图10可以看出，温度和树脂用量对多糖保留率影响显著，但二者的交互作用不显著。

（3）蛋白去除率交互作用响应面分析。由图11可以看出，温度和pH值对蛋白去除率影响显著，二者交互作用显著，吸附温度高于55 ℃或低于45 ℃都不利于蛋白质的去除，pH值接近5.0时蛋白去除效果较好。由图12可以看出，温度和树脂用量对蛋白去除率影响显著，二者交互作用明显。图13表明，pH值和树脂用量对蛋白去除率影响显著，二者交互作用显著，综合分析，3个因素对蛋白去除率影响明显，每两个因素交互作用显著，由等高线可以看出，pH值和树脂用量之间的交互作用更显著。

2.4 D301-R脱色除蛋白最佳工艺条件

通过Design-Expert 8.0软件分析，确定D301-R对龙眼多糖脱色除蛋白的最佳工艺条件为：温度47.81 ℃、pH4.96、树脂用量0.61 g/mL，此条件下脱色率为75.55%，多糖保留率为93.53%，蛋白去除率为91.55%。验证实验选取温度48 ℃，pH5.0，树脂用量0.61 g/mL进行。验证实验脱色率为（75.32±0.64）%，多糖保留率为（93.37±0.86）%，蛋白去除率为（91.83±0.79）%，表明实验结果合理可靠。

3 讨论与结论

脱色除蛋白是植物多糖纯化的步骤之一，相对于传统的Sevag法除蛋白、H2O2脱色等方法，大孔树脂具有操作便捷、成本低、效率高等优点[16-19]。目前，主要采用离子交换和吸附树脂对植物多糖进行脱色除蛋白。离子交换树脂主要通过离子键与带电荷的色素、蛋白质等杂质物质进行结合，达到除杂目的。吸附树脂主要通过分子内的疏水基相互作用进行吸附除去杂质。针对不同来源的的多糖，不同类型树脂的除杂效果不同。

本研究结果显示，7种树脂对龙眼粗多糖溶液具有不同的除杂效果，D301-R树脂具有相对较好的除蛋白脱色素效果。而同为阴离子交换树脂的D296除杂效果则较差，这一结果可能是由于两者的功能基团差异造成的。D301-R的功能基团为-N（CH3）2属于弱碱性，而D296的功能基团为-N+（CH3）3属于强碱性，在弱酸性条件下龙眼多糖主要为弱极性酸性多糖和中性多糖，所以D301-R具有更佳的脱色除蛋白效果和较低的多糖吸附量。研究显示，树脂孔径大小是影响其除杂效果的重要因素之一，当树脂孔径大小与溶液中色素大小适应时，更易于色素等被吸附达到除杂目的[20]。笔者的实验结果显示，孔径为85～90 μm的D3520和HPD-100A的除杂效果显著优于NKA-9树脂（孔径为155～165 μm），这可能是由于龙眼多糖溶液中的色素主要为小分子色素造成的。

本研究结果显示，D301-R树脂对龙眼多糖具有较好脱色除蛋白效果，经响应面实验优化，确定其最佳工艺条件为温度48 ℃，pH5.0，树脂用量0.61 g/mL，吸附时间2.0 h。在此工艺条件下，龙眼多糖的脱色率为75.32%，蛋白去除率为91.83%，多糖保留率为93.37%，其蛋白去除率、多糖保留率较文献报道[11-12]有显著提高。同时研究显示，在脱色除蛋白过程中，树脂可能会吸附部分糖-蛋白、糖-色素等络合物，造成多糖的损失。对龙眼多糖脱色除蛋白工艺还需进一步研究。

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