利用电激共转化法转化橡胶树悬浮细胞的初步研究

程汉 肖成江 祝建顺 安泽伟 黄华孙

摘 要 利用电激转化法对橡胶树悬浮细胞系进行转化，初步确定卡那霉素的筛选浓度、共转化的实验条件。通过电激共转化法将NPTII、GUS、EGFP和HbCBF1基因成功导入到橡胶树悬浮细胞并整合到基因组中。通过卡那霉素抗性筛选、GFP荧光观察和PCR验证等方法，确定外源DNA片段转化成功。共筛选得到95个抗性愈伤组织，其中9个愈伤组织经过PCR验证确定整合有外源DNA片段，1个愈伤组织共转化有NPTII和GUS基因。此结果表明电激共转化法可成功应用于橡胶树悬浮细胞转化操作。

关键词 橡胶树；电激转化；共转化；HbCBF1

中图分类号 S794.1 文献标识码 A

Abstract The rubber tree suspension cells were co-transformed using electroporation method. The co-transforming conditions and kanamycin concentration were determined. The NPTII， GUS， eGFP， and HbCBF1 genes were successfully transferred into suspension cells and integrated into genomes in rubber tree. The transgenes were validated by kanamycin resistance selection， GFP fluorescence detection and PCR amplification methods. Totally 95 kanamycin resistant calli were obtained， in which 9 harbored exogenous DNA fragments basing on the PCR validaton results. One callus was co-transformed with NPTII and GUS genes. These results demonstrated that electroporation co-transform method could be successfully applied in genetic manipulation in rubber tree.

Key words Rubber tree；Electroporation；Co-transform；HbCBF1

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.08.010

天然橡胶是重要的战略物资，巴西橡胶树作为最主要的天然橡胶来源，在中国热区大量种植，既保障了中国的战略物资供给，也为热区农民提供了可靠的经济收入来源。橡胶树是多年生的高大乔木，异花授粉。其品种选育主要采用常规育种方法，父母本材料均来源于魏克汉品系及其衍生的无性系。由于育种周期长、遗传基础狭窄、多基因杂合等因素，使得橡胶树的传统杂交育种及杂种优势的利用受到限制。因此，探索育种新技术、缩短育种周期、提高育种效率、克服传统育种的缺陷具有重要理论及现实意义。近些年，转基因育种技术迅速发展，该技术能迅速导入新性状、加快育种周期，并已在水稻、大豆、玉米和棉花等作物中得到大量应用[1-4]。

橡胶树对低温极其敏感，寒害严重影响橡胶单产及橡胶树的经济寿命。低温寒害是限制中国天然橡胶种植的主要环境限制因子。长期以来，抗寒育种始终是中国橡胶树育种的一个主要研究方向。近几年，随着橡胶树抗寒分子机理研究的进展，获得了一些与橡胶树抗寒密切相关的基因，如HbCBF1等[5-8]。这些基因为橡胶树抗寒转基因育种提供了可供选择的基因来源。然而，由于橡胶树转基因技术研究相对滞后，使得这些基因的应用受到严重限制。在橡胶树中，由于转基因技术尚未完善，使得转基因育种技术的应用严重滞后。在已经发表的橡胶树转基因技术研究中，多数是以花药为外植体，诱导愈伤组织，再通过农杆菌介导，或基因枪法将外源基因片段导入细胞中[9-12]。由于橡胶树每年花期时间短，使得转基因所需的外植体来源受到季节性限制。利用橡胶树细胞悬浮培养物不仅可在短时间内获得大量细胞，还可不受季节性限制开展研究。利用悬浮体系进行电激转基因研究，一方面能以大量体细胞群体为基础，高效进行转化研究；另一方面，根据前期研究结果，电激转化能取得比农杆菌等其他方法更高的转化效率[13]，且能在短时间内得到大量的转化细胞，为获得阳性转化植株提供更多起始材料。电激转移法是利用电脉冲使细胞膜发生瞬时的可逆穿孔，从而使游离的外源基因穿过细胞膜而进入到细胞中去，电穿孔操作对受体细胞产生的扰动很小，从而保持了活细胞的正常生理条件。电穿孔的脉冲参数和过程容易控制，强度适当的电脉冲不会使DNA和受体细胞受到任何损害。因此，电激转移是一种很好的基因转移方法，操作简单，转化效率高，没有细胞种属限制。细胞电穿孔技术对各种类型的细胞具有高效率、低毒性、普遍性和可控制性的优点，目前已广泛用于细胞工程和基因工程方面。在植物中也大量开展了电激基因转移技术的研究，如大白菜[14]、水稻[15]、玉米[16]等。本研究以橡胶树细胞悬浮系为受体材料，研究电激共转化法介导转化抗寒基因HBCBF1，探讨培育抗寒转基因橡胶树的可行性。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验以中国橡胶树杂交种B1（Hevea brasiliensis×H. nitida）细胞悬浮系为材料[13]。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 悬浮细胞的培养参照肖成江等[13]的方法，继代周期为7～9 d。愈伤组织诱导实验选取生长状态良好的橡胶树悬浮细胞，接种至易碎胚性愈伤组织诱导培养基上诱导易碎胚性愈伤组织，30 d后统计愈伤组织诱导率。易碎胚性愈伤组织诱导率=易碎胚性愈伤组织数/悬浮细胞团数×100%。

1.2.2 质粒表达框的构建 EGFP、GUS、NPTII基因分别来自pCAMBIA1302载体和pCAMBIA2301载体，通过PCR法从载体上扩增，HbCBF1基因来自本实验室克隆。将EGFP、GUS、HbCBF1和NPTII基因的编码区通过亚克隆分别插入至pBI221载体的XbaI和SacI酶切位点间，形成如图1所示的表达框结构。线性表达框的制备采用PCR法，根据载体序列在表达框两侧设计可扩增完整表达框的上下游引物：上游P1： 5′-TGTAAAACGACGGCCC

AGT-3′，下游P2： 5′-CAGGAAACAGCTATGACC-3′。

将质粒稀释500倍后作为模板进行扩增。PCR产物取1 μL经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并经过酒精沉淀后回收备用。

1.2.3 电激法转化 电激转化操作根据肖成江等[13]的方法进行。按照1 ∶ 1 ∶ 1等摩尔比例加入线性化的EGFP、NPTII和HbCBF1基因片段进行电激转化。电激后将细胞静置培养24 h，小心地移去上清液，用MS液体培养基洗涤3次。将洗涤后的细胞在愈伤组织诱导培养基（附加卡那霉素）中进行培养，并诱导其愈伤组织形成。

1.2.4 瞬时表达率和细胞成活率的测定 将恢复培养后的细胞悬液滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于荧光显微镜（Leica）下进行细胞荧光观察。EGFP在蓝光激发下呈现绿色荧光。随机计数5个视野悬浮细胞，记下呈现绿色荧光的细胞数，独立重复3次试验，按下式计算瞬时表达率：

细胞成活率测定加入500 μL 0.01% FDA（荧光素双醋酸酯），室温下静置5～10 min后，在荧光显微镜下进行观察。有活力的细胞在蓝光激发下呈现绿色荧光。随机计数5个视野悬浮细胞，记下呈现绿色荧光的细胞数，独立重复3次试验，按下式计算细胞成活率。

1.2.5 卡那霉素选择压对转化的影响 采用平铺法对电激后的B1悬浮细胞进行选择。将悬浮细胞均匀平铺在含卡那霉素的愈伤组织诱导培养基M2中进行培养。卡那霉素浓度分别为：0、50、75、100、125、200 mg/L。培养4～6周后，观察并统计胚性愈伤组织的形成情况，以确定适宜的卡那霉素筛选浓度。

1.2.6 转化愈伤组织的鉴定 （1）转化愈伤组织EGFP荧光观察：具有卡那霉素抗性的愈伤组织在培养基上能够正常生长，且呈现鲜黄色，而非抗性愈伤组织则褐化死去。电激转化12 h后，用荧光显微镜观察转化愈伤组织中EGFP的表达，使用I3滤光片组进行观察，激发波长范围为450～490 nm，检测波长为515 nm。

（2）转化愈伤组织的PCR法鉴定：电激转化悬浮细胞，并经过2个月培养后，提取形成的抗性愈伤组织基因组DNA，通过PCR法鉴定外源DNA片段是否成功整合进入橡胶树基因组中。分别使以下引物对进行扩增：HbCBF1基因引物：5′-ATCAAAGGCCATGGAGTCAA-3′和5′- TCCTAATGTCCTTTGCTTCTCTG-3′；NPTII基因引物：5′- AAAGCACGAGGAAGCGGTCAGC-3′和5′-TGGAGAGGACACGCTGAAATCACC-3′；GUS基因引物：5′-GAAATTCCATACCTGTTCACCGACGACG-3′和5′-TGCTGCGTTTCGATGCGGTCAC-3′。扩增HbCBF1基因的引物有一条来自CaMV 35S启动子序列，以避免扩增出内源HbCBF1基因。最后PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

2 结果与分析

2.1 表达框的构建

根据实验设计，将EGFP、GUS、NPTII和HbCBF1基因分别克隆至目标载体中，构建出如图1所示的表达框。

构建的质粒经过大量抽提纯化、PCR扩增，得到DNA片段分别为线性EGFP、GUS、NPTII和HbCBF1基因表达框，将核酸共沉剂或PCR产物回收纯化，得到相应的片段沉淀，经1.0%琼脂胶鉴定纯化片段并测定线性表达框各DNA的浓度（图2）。

2.2 抗性选择压浓度的确定

首先测试悬浮细胞在含有卡那霉素的培养基中平铺培养的生长情况。在不添加卡那霉素的培养基中，悬浮细胞生长旺盛，诱导愈伤组织率接近100%，平铺1个月后，培养基中长满黄豆般大小的小愈伤组织。在分别添加了50、75、100、125 mg/L卡那霉素的培养基中，经过2个月的培养，胚性细胞团形成率分别为53.24%、31.48%、11.87%、2.14%（图3和图4）。

采用平铺法进行抗生素的抗性筛选，有利于转化细胞充分接触培养基，以确保其生长。同时随着培养时间的延长，愈伤组织对卡那霉素的耐受能力逐渐增强。因此，本研究确定在胚性愈伤组织诱导及增殖阶段卡那霉素的筛选浓度均为100 mg/L。

2.3 EGFP基因在转化愈伤组织中的表达情况

电激共转化并经过15 d继续培养后，将米粒大小的愈伤组织放在荧光显微镜下观察，发现部分小愈伤组织能发出绿色荧光（图5），初步判断为转化的愈伤组织。

2.4 PCR鉴定转化愈伤组织

经过选择培养存活下来的愈伤组织为潜在的转化愈伤组织（图6）。提取95个愈伤组织样品的基因组DNA，经过PCR检测，结果发现阳性的愈伤组织有9个。其中带有HbCBF1基因表达框的愈伤组织有4个，带有NPTII基因表达框的愈伤组织有4个，带有GUS基因表达框的愈伤组织有2个。只有1个愈伤组织同时整合有NPTII和GUS基因（图7）。从共转化的效率来看，共同转化的愈伤组织数量较少，原因可能有2个：一是卡那霉素的筛选效率不高。在95个抗性愈伤组织中，仅有4个检测出NPTII基因，大大降低了阳性检出率。二是阳性样本数量偏少，导致共转化检出率偏低，统计结果见表1。

3 讨论与结论

本研究中，利用电激转化法对橡胶树悬浮细胞进行初步研究，成功将HbCBF1等基因的线性表达框整合进入橡胶树基因组中，并得到了卡那霉素抗性愈伤组织，这表明电激转化方法能成功应用于橡胶树的遗传转化，并且具有巨大的潜在应用前景。本研究还通过共转化策略将标记基因和目的基因同时整合到目标基因组中。在实验中，以1 ∶ 1 ∶ 1混合含有目的基因和含有标记基因的DNA片段进行共转化，共筛选获得转化愈伤组织为95个。经过PCR鉴定，其中9个愈伤组织带有外源DNA片段，仅有1个愈伤组织共转化了NPTII和GUS基因，转化效率相对低下。笔者分析其中原因：一是检测成功转化的样品数量太少，不能代表真正的比例；二是使用卡那霉素进行筛选效率不高，在95个卡那霉素抗性的愈伤组织中，仅有4个检测到整合有NPTII基因片段。因此，下一步工作需要进一步提高卡那霉素的筛选浓度，或者更换更高效率的潮霉素进行筛选，以提高筛选的效率。利用悬浮细胞基数大的特点，高效筛选出转化阳性愈伤组织。在此基础上，再进一步优化共转化比例，以完善橡胶树悬浮细胞电激转化体系。

近年来，中国在利用农杆菌介导转化橡胶树愈伤组织方面取得了一些突破性进展[9-10，17]，但总的来看，橡胶树遗传转化效率还很低下，操作相对困难。一方面限制了该技术的进一步应用，另一方面，也制约了橡胶树转基因育种研究，使得许多克隆和鉴定到的基因无法进一步在橡胶树中进行验证和应用。本研究初步探索了电激转化法在橡胶树悬浮细胞中的应用，获得了一些整合有外源DNA片段的抗性愈伤组织，也成功筛选到了共转化愈伤组织。这表明在橡胶树中利用电激共转化进行转基因操作的可行性，为该方法的进一步应用奠定了初步基础。

同之前的农杆菌介导转化愈伤组织策略相比[9，11-12，18]，本研究中使用的电激转化技术未使用农杆菌和T-DNA载体，仅仅通过线性表达框即可将目标基因整合到基因组中，使得载体构建变得十分简单。另外，由于未使用农杆菌，电激转化法无需使用抑制农杆菌的抗生素，降低了实验成本，也没有农杆菌污染的风险，提高了实验的成功率。同农杆菌介导转化相比，电激转化的受体材料是悬浮细胞系，具有群体大的特点。因此，即使橡胶树离体组织的转化率十分低下，仍然能获得相当多的转化细胞，大大提高了获得转基因愈伤组织的可能性。然而，目前，电激转化法还存在着不足之处，主要是共转化频率过低，使得多基因转化的成功率大大降低。另外，电激转化必须使用悬浮细胞系，使得转基因操作的前期准备工作变得复杂，这些制约因素还需要在后续研究中加以克服和改进。

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