杂种蓝莓(野生ב美登’)组培快繁1)

甄成　毕显禹　李淑娟　　　　孙小环　许艳玲　石德山

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)　　　　(大兴安岭地区农业林业科学研究院)



杂种蓝莓(野生ב美登’)组培快繁1)

甄成毕显禹李淑娟孙小环许艳玲石德山

(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，哈尔滨，150040)(大兴安岭地区农业林业科学研究院)

摘要为了建立高效的杂种蓝莓组培快繁技术体系，以大兴安岭地区野生蓝莓和栽培品种‘美登’(‘Blomidon’)杂交获得的杂交种子为试材，筛选出杂交种子最佳无菌处理条件，获得蓝莓杂种无菌苗。再以杂种无菌苗茎段为外植体，探究了不同质量浓度植物生长调节剂(ZT)、蔗糖及继代周期对丛生芽诱导的影响，并探讨了培养基种类及植物生长调节剂IBA质量浓度对生根诱导的影响。结果表明：杂交种子经75%酒精和3%次氯酸钠分别处理20 s和7 min效果最好，污染率为0；添加0.6 mg·L-1ZT和20 g·L-1蔗糖的WPM培养基为丛生芽诱导最佳培养基，诱导率高达100%，且芽丛密集、长势好；芽诱导期间，30 d的继代周期最有利于丛生芽的增殖，增殖倍数高达34.72；最佳生根培养基为添加0.4 mg·L-1IBA的1/2WPM培养基，生根率高达88%，且生根周期仅为40 d，移栽成活率达到85%以上。

关键词蓝莓；野生ב美登’；杂交种子；组织培养；快速繁殖

分类号Q943.1

Rapid Propagation System of Hybrid Blueberry (wildבBlomidon’)//

Zhen Cheng, Bi Xianyu, Li Shujuan

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Sun Xiaohuan, Xu Yanling, Shi Deshan(Daxing’an Mountain Academy of Agriculture and Forestry Sciences)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(5)：29-33.

The objective of the study is to establish a rapid propagation system of hybrid blueberry. The wild blueberry of Daxing’an Mountains and the cultivar of ‘Blomidon’ were selected as parents to take intervarietal crosses and the hybrid seeds. The best sterile treatment conditions for hybrid seeds were selected and the sterile seedlings were got. The effects of the concentration of ZT, the contents of source and subculture cycle on frequency of cluster buds induction were conducted by using stem segments of seedlings as explants. The influence of different types of medium and concentration of IBA on the induction of adventitious root was analyzed. The contamination rate of hybrid seeds was 0 after sterilized with 75% ethanol and 3% sodium hypochlorite for 20 s and 7 min, respectively. The best medium for cluster buds induction was WPM containing 0.6 mg·L-1ZT and 20 g·L-1source. The induction rate was up to 100% and the cluster buds grew well. During the bud induction, the optimal subculture cycle for buds proliferation was 30 d with the proliferation coefficient of 34.72. The best rooting medium was 1/2WPM containing 0.4 mg·L-1IBA, the rooting rate was 88%, and the rooting period was only 40 d. The survival rate of transplanting was more than 85%.

KeywordsBlueberry; WildבBlomidon’; Hybrid seed; Tissue culture; Rapid propagation

蓝莓是杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vacciniodeae)植物的总称，为多年生灌木或小乔木，因其果实富含抗氧化剂、花色素苷、类黄酮等与清除人体自由基和抗衰老机能密切相关的化合物，深受国内外广大消费者的追捧，目前已跻身于世界五大健康食品行列，并有世界水果之王的美誉[1-2]。

我国野生蓝莓分布广泛，集中分布在大、小兴安岭及长白山地区，而大兴安岭野生蓝莓产量占全国总量的70%以上，占世界总量的20%左右[3]。大兴安岭野生蓝莓耐寒性极强，适合生长在有季节性积水的沼泽地和潮湿山坡，因其生长受环境影响大，因此很难驯化为栽培品种。近年来，大兴安岭引进的栽培品种‘美登’是加拿大农业部肯特维尔研究中心从野生矮丛越桔(VacciniummytilloidesMichx)中自然选种选出的‘Augusta’，又与‘451’杂交选育出的蓝莓品种，1986从美国俄勒岗州国家种质资源库引入我国，1998年经吉林省作物品种委员会审定并命名[4]。‘美登’属矮丛蓝莓，为中熟种，其生长势强，自然坐果率达到97%，平均比野生增产643.6%[4]，且果实口感好，抗寒力较强，但在大兴安岭地区仍需保护才能越冬。此外，蓝莓用种子繁殖萌发率低、耗时长[5]，20世纪80年代发展起来的植物组培技术不受季节限制，可以在短时间内获得大量无菌苗，提高繁殖系数，而且可以保持品种的优良性，在果树育种领域得到广泛应用。目前，国内外关于组培繁殖蓝莓已有诸多报道[6-9]。

针对北方高寒地区自然环境优越，但缺乏耐寒的优良蓝莓栽培品种这一问题，2013—2014年，东北林业大学与大兴安岭地区农业林业科学研究院浆果研究室合作，利用野生蓝莓和引进的栽培品种‘美登’进行杂交，获得了F1种间杂交种子。由于杂交种子数量有限，为了缩短育种周期，本研究对杂种蓝莓(野生ב美登’)的组培快繁技术进行了深入研究，建立了杂种蓝莓组培快繁技术平台，为蓝莓种质资源创新和蓝莓杂交新品种的培育奠定了基础。

1材料与方法

2013—2014年，在大兴安岭地区农业林业科学研究院蓝莓试验基地以当地野生蓝莓为母本，与经长期引种驯化的栽培品种‘美登’为父本进行人工杂交，获得的杂交种子为基础试验材料，再以杂交种子经无菌萌发得到的组培苗茎段为外植体进行组培快繁研究，组培试验在林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)进行。

杂交种子的消毒与萌发：首先以亲本种子为对照进行预试验，用70%酒精分别处理20、40 s，再用3%的次氯酸钠分别处理3、5、7 min、无菌水清洗3遍后分别放入小三角瓶中，密封，在25 ℃、120 r·min-1的条件下震荡2 d再更换100 μg·g-1的赤霉素溶液浸泡1 d，最后用无菌滤纸吸干种子表面水分，分别接种于无激素添加的WPM培养基中，暗室培养，每个重复接种30粒种子，每个处理重复3次，7 d后统计污染率，15 d后统计无菌苗获得率，并移至光下培养。将筛选出的最优方案用于杂交种子的无菌处理，再以杂交种子萌发获得的无菌苗茎段为外植体进行组培快繁研究。

激素及蔗糖质量浓度对丛生芽诱导的影响：以高达7～8 cm的无菌苗为材料，将其剪成长2～3 cm的茎段，垂直接种于含有不同质量浓度ZT(0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L-1)和不同质量浓度蔗糖(10、20、30 g·L-1)的WPM培养基中诱导不定芽，添加琼脂6.0 g·L-1，每个重复接种30个外植体，每个处理重复3次。每天观察并记录各处理的诱导状态，60 d后统计出芽率、平均株高和增殖倍数。

继代周期的选择：将生长状态相对一致的植株剪成2～3 cm长的茎段，垂直接种到添加0.6 mg·L-1ZT、20 g·L-1蔗糖的WPM培养基中，分别以20、25、30、35、40 d为继代周期，每个重复接种20个外植体，每个处理重复3次，培养60 d后统计并记录平均株高、增殖倍数及植株生长状态。

组培苗的生根培养：将生长健壮的丛生芽分离成单株，选取生长状态一致的植株，剪成3 cm长的茎段垂直接种到生根培养基中，插入深度为0.5～1.0 cm。生根培养基以WPM、1/2WPM为基本培养基，添加IBA质量浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·L-1，添加蔗糖20 g·L-1、琼脂6.0 g·L-1、活性炭1.0 g·L-1。每个重复接种30个单株，每个处理重复3次，培养40 d后统计并计算生根率、平均生根数和平均株高。对生根组培苗进行炼苗和移栽，1个月后对苗木成活率进行统计。

培养基及培养条件：试验中所用培养基pH值均在灭菌前用KOH调至5.4，121 ℃高压灭菌20 min，灭菌后温度降至60 ℃以下时添加相应的激素。若无特殊说明，各阶段试验材料均在光下培养，光照时长16 h·d-1，光照强度40 μmol·m-2·s-1，培养温度(24±1)℃。

数据统计与分析：污染率=(污染种子数/接种种子数)×100%；

无菌苗获得率=(获得无菌苗数/接种种子数)×100%；

出芽率=(出芽外植体数/接种外植体数)×100%；

生根率=(生根外植体数/接种外植体数)×100%；

增值倍数=增殖芽数/接种外植体数。

试验数据采用SPSS18.0进行方差方析，应用Duncan检测方法进行多重比较。

2结果与分析

2.1消毒剂种类及处理时间对消毒效果的影响

最佳无菌处理条件应在保证最大程度降低材料污染率的同时，又要使其伤害降到最小。接种3 d部分杂交种子出现污染现象，且污染率随着消毒剂处理时间的延长而下降，由表1可知，当3%次氯酸钠处理时间延长至7 min时污染率均为0，但酒精处理时间较长会对种子造成伤害，从而降低无菌苗的萌发数量。因此，75%酒精处理20 s和3%次氯酸钠处理7 min为最佳无菌处理组合，污染率为0，无菌苗获得率高达95.04%。此外，由表1可以看出，在污染率为0的情况下，无菌苗获得率仍没有达到100%，这是由于少量种子发育不饱满，对消毒处理最佳方式的筛选不会产生影响。

2.2激素、蔗糖质量浓度对丛生芽诱导的影响

无菌茎段接种到芽诱导培养基中，培养7～10 d基部开始膨大产生少量绿色愈伤，15～18 d外植体基部产生少量丛生芽，且幼芽随着培养时间的延长而增多。ZT对丛生芽诱导情况见表2，经方差分析和多重比较可知，ZT质量浓度对杂种蓝莓出芽率、株高和增殖倍数影响均达到显著差异。其中出芽率随着质量浓度的升高呈现逐渐上升的趋势；株高随着质量浓度的升高呈现先上升后下降的趋势；增殖倍数随着质量浓度的升高呈现逐渐上升的趋势，由此可见，ZT质量浓度较低时，苗生长较快，但分化数量少。当ZT质量浓度达0.6 mg·L-1时，出芽率达到100%，且丛生芽分化密集，长势好，植株相对较高；当ZT质量浓度为0.8 mg·L-1时，出芽率仍为100%，丛生芽密集，增殖倍数高，但芽丛基部愈伤较大，植株矮小，且部分芽轻微玻璃化。由此可知，杂种蓝莓增殖倍数随着ZT质量浓度的增加而变大，但是超过一定质量浓度时，植株生长状态变差，株高受到限制。同时，由表2可知，蔗糖质量浓度对杂种蓝莓出芽率、株高和增殖倍数影响均达到差异显著水平。在ZT质量浓度相同的情况下出芽率和株高均随着蔗糖质量浓度的增多呈现上升的趋势，而增殖倍数随蔗糖质量浓度的增多呈现先上升后下降的趋势，当蔗糖质量浓度为20 g·L-1时增值倍数达到最高。试验还发现，蔗糖作为培养基中碳水化合物的主要来源，其质量浓度的高低不仅对芽的增殖影响显著，而且对植株生长状态也有显著影响。因此，综合两者对丛生芽诱导的影响，0.6 mg·L-1的ZT，20 g·L-1的蔗糖最适合杂种蓝莓丛生芽诱导。

表1　消毒剂种类及处理时间对消毒效果的影响

注：表中部分数据为平均值±标准差；同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

表2　ZT、蔗糖质量浓度对芽诱导的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

2.3继代周期对丛生芽诱导的影响

培养基为组培苗的生长提供必须的营养物质，经过一段时间的培养，培养基内的营养成分会因植株的吸收而减少，因此必须选择合适的继代周期来保证植株处于旺盛的生长状态。由表3可知，继代周期对杂种蓝莓株高和增殖倍数影响均显著，二者随着继代周期的延长呈现先升高后降低的趋势。其中继代周期为30 d时，丛生芽增殖倍数高达34.72，达到最高，分别比继代周期为20、25、35、40 d植株的平均增殖倍数高出27.88%、15.58%、16.00%、38.94%，且丛生芽生长状态最好。因此，杂种蓝莓丛生芽诱导的最佳继代周期为30 d，芽诱导情况见图1。

表3　继代周期对丛生芽的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图1　杂种蓝莓丛生芽诱导

2.4培养基及IBA质量浓度对组培苗生根的影响

杂种蓝莓无菌苗在生长素IBA的作用下，培养10～15 d基部开始有须根长出，经过40 d的培养，经不同质量浓度IBA处理的植株生根率均在45%以上，而不添加IBA的情况下，生根率仅达到35.28%，由此可见，IBA对杂种蓝莓不定芽生根有显著的促进作用,但不同质量浓度下生根效果也有较大差异。由表4可知，不同质量浓度IBA对杂种蓝莓生根率、平均生根数和平均株高都有显著影响，且三者在同一种培养基培养过程中都随IBA质量浓度的升高呈现先升高后降低的趋势，当IBA质量浓度为0.4 mg·L-1时，杂种蓝莓植株在两种培养基中生根率、生根条数和株高均达到最高水平，当IBA质量浓度为0.8 mg·L-1时，生根率和平均根数均明显下降，由此可知，过高的IBA质量浓度对杂种蓝莓生根起到明显抑制作用。由表4还可看出，在IBA质量浓度相同的情况下,杂种蓝莓植株在基本培养基1/2WPM上的生根效果明显优于在WPM上的，由此可知，低盐更适合杂种蓝莓生根。因此，添加0.4 mg·L-1IBA的1/2WPM培养基是杂种蓝莓生根培养的最佳培养基，生根情况见图2。

表4　培养基种类及不同质量浓度IBA对生根的影响

注：表中数据为平均值±标准差；同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

图2　杂种组培苗生根

2.5炼苗及移栽

生根组培苗在培养室内开盖炼苗2 d后再移入温室炼苗2 d，炼苗结束后小心将瓶苗取出，用清水洗净附着于根部的培养基，不要伤根。然后将其定植于含有苔藓的穴盘中，苗要直立，根部用基质埋实，浇透水。移栽后1～2周温室内空气湿度控制在80%～90%，以免苗木失水，并进行适当遮阳，避免午间强光照射。整个培养过程中温室内温度控制在24～28 ℃，栽培基质保持足够的湿度，苗木成活率达到85%以上，移栽后幼苗长势及根部发育状态见图3、图4。

3结束语

以杂种蓝莓种子为材料，通过消毒和无菌萌发获得组培苗，并以组培苗茎段为外植体，通过对不同培养基、激素配比、蔗糖质量浓度及继代周期对丛生芽诱导及生根进行研究，建立了杂种蓝莓组培快繁技术体系。

图3　移栽后的长势

图4　根部发育状况

有研究表明，Anderson、WPM和MS培养基均适合蓝莓快繁,但WPM的效果最好[10]，因此,本研究选用WPM为基本培养基，探究影响杂种蓝莓丛生芽诱导及生根的各个因素。Billings et al.[11]研究显示，细胞分裂素对蓝莓丛生芽的诱导和增殖有显著影响，而生长素几乎没有影响；有研究表明，蔗糖质量浓度对蓝莓丛生芽诱导影响显著，且不同品种最适质量浓度不尽相同[12]。在以往研究基础上，本研究以ZT质量浓度、蔗糖质量浓度及继代周期作为杂种蓝莓丛生芽诱导的主要影响因素，试验表明，0.6 mg·L-1的ZT和20 g·L-1的蔗糖对杂种蓝莓丛生芽诱导效果最佳，诱导率达到100%，远高于马艳丽[13]报道的关于半高丛和矮丛越桔85.3%的再生频率。同时，30 d的继代周期使丛生芽增殖倍数高达34.72，与以往研究相比具有明显优势[14]。

关于蓝莓瓶内生根报道较多，多数报道显示,蓝莓存在生根率低、生根周期长的问题，且不同品种间所需生根条件也有一定差异[15-16]。有研究发现，生长素IBA较NAA更适合蓝莓组培苗生根培养[17-18]。因此，本研究以IBA质量浓度及培养种类作为杂种蓝莓生根培养的主要影响因素，研究表明，杂种蓝莓在IBA质量浓度为0.4 mg·L-1的1/2WPM培养基中生根效果最好，生根率高达88.19%，生根条数及苗高均达到较好水平，且生根周期仅为40 d左右。生根组培苗经炼苗移栽到穴盘的苔藓中，成活率达到85%以上。

本研究建立了高效的杂种蓝莓(野生ב美登’)组培快繁技术体系，对杂种蓝莓的保存和繁育具有重要意义。在此基础上对获得的蓝莓杂种进行区域试验和进一步选择，有望为我国高寒地区蓝莓新品种的培育和利用奠定坚实基础。

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收稿日期：2015年11月25日。

第一作者简介：甄成，女，1990年11月生，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)，硕士研究生。E-mail:364598894@qq.com。通信作者：李淑娟，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学),高级工程师。E-mail:lishujuan@126.com。

1)林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学)创新项目(2015B03)、大兴安岭行署科技局博士后项目资助(2012A02)。

责任编辑：任俐。