梅毒螺旋体Tp0453-Tp0257重组融合蛋白的表达及作为梅毒诊断候选抗原的初步研究*

郭龙华，彭小丽，伍晓飞，吴文权，刘梦琼

(1.深圳市龙华新区人民医院检验科，广东 深圳 518109；2.深圳市光明新区人民医院田竂社康中心；3.海南省人民医院检验科)



梅毒螺旋体Tp0453-Tp0257重组融合蛋白的表达及作为梅毒诊断候选抗原的初步研究*

郭龙华1，彭小丽1，伍晓飞2，吴文权1，刘梦琼3**

(1.深圳市龙华新区人民医院检验科，广东 深圳 518109；2.深圳市光明新区人民医院田竂社康中心；3.海南省人民医院检验科)

摘要：目的 本研究旨在探讨梅毒螺旋体Tp0453-Tp0257重组融合蛋白检测梅毒感染的可能性。方法 用基因合成的方法构建重组pET-28a-Tp0453-Tp0257质粒，重组融合蛋白的鉴定用SDS-PAGE和Western blot分析鉴定，重组融合蛋白作为抗原用于ELISA实验，该蛋白的灵敏度用来自一期、二期、三期和隐性梅毒患者的血清(90例)进行评估，其特异性用正常体检者的血清(120例)评估。结果 Western Blot分析证实了Tp0453-Tp0257重组融合蛋白能与梅毒阳性血清反应。该蛋白对梅毒诊断的总灵敏度为97.8%、总特异性为100.0%。结论 本实验Tp0453-Tp0257重组融合蛋白作为新的梅毒特异诊断的候选抗原，取得较好的实验效果，有望进入临床推广使用。

关键词：梅毒；Tp0453；Tp0257；重组融合蛋白；酶联免疫吸附试验(ELISA)

梅毒(Syphilis)由梅毒密螺旋体苍白亚种(TP)引起，近几年国内梅毒感染者有明显的增多趋势[1]，青霉素治疗梅毒有效，但仍然全球流行，部分原因是由于目前检测方法不够灵敏和特异[2]。梅毒螺旋体的实验室检测主要包括：病原体、非特异性抗体、特异性抗体及基因的检测。目前应用较多的检测方法是血清学抗体检测。

膜蛋白是TP的主要免疫原，能刺激机体产生强烈的抗体反应,多种膜蛋白对TP具有诊断学意义和免疫保护作用，这为TP诊断和疫苗候选基因奠定了基础。近年来，用纯化的重组蛋白作ELISA包被抗原，其敏感性和特异性均有所提高[3]。已有不少学者采用基因工程重组技术表达了具有高度免疫原性的TP膜蛋白Tpp47(Tp0574)、Tpp17(Tp0425)、Tpp15(Tp0171)、Tpp44.5(TmpA)中的一种或多种，并用其建立梅毒抗体的血清学检测方法，能显著提高检测的特异性和敏感性,但也存在一些问题，不同患者不同梅毒感染阶段对这些膜蛋白具有不同的抗体谱，因而对梅毒的诊断灵敏度和特异性存在差异[4]。

由于Tp0453蛋白位于TP细胞外膜，整个分子的抗原性均较强，其编码产物与其他细菌无同源性[5]。Smith BC等人的研究显示重组Tp0453蛋白作为ELISA的诊断抗原其敏感性达到98%，特异性达到99%[2]。膜蛋白Tp0257(Gpd)抗原性强，研究显示以重组Tp0257(Gpd)蛋白抗原检测早期梅毒、晚期梅毒和神经梅毒的敏感性和特异性分别为9l%和93%[6]。Tp0257蛋白基因因其不仅存在于所有TP各亚种基因组中，而且其序列高度保守，抗原性强，而被认为是更合适的TP疫苗候选基因。 虽然Tp0453蛋白和Tp0257蛋白有各自的优点，但未见Tp0453-Tp0257重组融合蛋白用于诊断梅毒的研究报道。在本研究中，我们构建Tp0453-Tp0257重组融合蛋白作为诊断梅毒的抗原，并用不同梅毒感染阶段的血清评价该重组蛋白对于梅毒诊断的意义。

1材料与方法

1.1构建能表达Tp0453-Tp0257重组质粒pET-28a-Tp0453-Tp0257从GeneBank获得Tp0453和Tp0257的序列，委托上海吉凯生物科技有限公司合成Tp0453和Tp0257序列，它们之间用(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)3 [(GGGGS)3]连接，然后以pET-28a为质粒载体制备重组质粒pET-28a-Tp0453-Tp0257，并用DNA测序证实构建的质粒是正确的。

1.2Tp0453-Tp0257重组融合蛋白的表达和纯化将测序正确的pET-28a-Tp0453-Tp0257质粒转化至BL21(DE3)pLysS感受态细胞中(康为世纪货号：CW0810A)涂板过夜培养。挑选若干外形饱满的单克隆菌落于5ml LB培养基过夜培养，后以1∶100比例接入10ml培养基中37℃培养3h，加入终浓度为0.8mM的IPTG，30℃培养5h，收样。收集菌液，加loading buffer裂解，上样。SDS-PAGE分离胶浓度：10%，上样量10μl。如果挑选能够表达重组Tp0453-Tp0257的菌株扩大培养后，超声破碎细菌，离心，用上样缓冲液(20 mM Tris (pH 7.5)，500 mM NaCl，20 mM咪唑)重悬，按照Ni2+-His-Resin试剂盒(南京金斯瑞生物科技有限公司)纯化蛋白的方法纯化重组Tp0453-Tp0257，用Western Blot方法鉴定。

1.3Western Blot分析不同样品进行SDS-PAGE电泳后，转膜到PVDF膜上，以梅毒阳性血清为一抗( 1∶1000)， 以羊抗人IgG( 1∶3000)作为二抗进行 Western blot 检测，拍照记录结果。

1.4ELISA方法的建立建立间接测定法，用96孔酶标板包被抗原/包被液(pH8.6 0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)，4℃过夜后，用洗涤液(pH7.40,0.02mol/L PBS-0.05% Tween 20)洗涤，然后4℃冰箱保存。将测定血清在反应板孔中用稀释液(pH7.40,0.02mol/L PBS-0.05% Tween 20 含5%小牛血清)1∶10稀释混匀后，放置37℃孵育30min,洗涤三次吸干后，每孔加酶标记物100μl，放置37℃孵育30min， 取出洗涤五次吸干后，加入邻苯二胺溶液显色。37℃暗室10min，用1mol/L硫酸终止反应，用酶标仪450nm测定各孔A值。

1.5抗原浓度的选择分别用5，10，20和25μg /ml抗原浓度包被，用梅毒抗体阳性对照血清测定，其测定结果的数据无明显差异，本文选用了5μg /ml作为包被浓度。

1.6血清标本的收集及检测正常人健康体检人员120名，一期梅毒 40例、二期梅毒15例、三期梅毒20例、隐性梅毒15例。所检测的血清均用甲苯胺红不加热血清试验(TRUST)过筛和梅毒微粒凝集试验(TPPA)确认。阴、阳性质控对照血清分别用Blot-Vision TP-45(Western Blot)和TPPA方法进行确认。

2结果

2.1重组质粒pET-28a-Tp0453-Tp0257的鉴定重组质粒pET-28a-Tp0453-Tp0257的鉴定是用DNA测序进行鉴定，结果表明重组质粒构建成功。

2.2SDS-PAGE分析Tp0453-Tp0257重组融合蛋白在原核生物中的表达收集处于对数期转化到BL21的细菌(OD=0.6)，用上样裂解液处理细菌后离心，去上清液10μl，用SDS-PAGE分析。结果见图1(封三)，从图1可以看出有一条分子量为70kD的蛋白表达，与所预测的分子量一致。

2.3Western Blot鉴定Tp0453-Tp0257重组融合蛋白的表达Western blot 检测显示，Tp0453-Tp0257重组融合蛋白与梅毒患者血清反应，与梅毒阴性患者血清均不发生反应，呈现良好的梅毒血清学反应活性，见图2(封三)。

2.4ELISA方法的建立和临床标本的检测由于以5、10、20和25μg /ml作为包被浓度能与卫计委检验中心得到的梅毒血清均有阳性反应，且检测结果无限制性差异，我们选择以5μg /ml作为包被浓度。然后我们对从临床收集的梅毒阳性标本和阴性标本进行检测，实验结果表明该蛋白对梅毒诊断的总灵敏度为97.8%(88/90)、总特异性为100.0%(120/120)。见表1。

表1　Tp0453-Tp0257重组融合蛋白包被的ELISA对临床标本的检测[n(%)]

3讨论

目前用于梅毒血清学诊断的许多重组抗原是脂蛋白，如Tpp44.5，Tpp15,Tpp17和Tpp47。脂蛋白抗原通过TLR2(Toll-like receptors2)激活抗原呈递细胞，刺激强烈的免疫反应[7]。这些TP外膜蛋白已联合应用于 ELISA梅毒检测试剂盒中，但仍有假阳性和早期梅毒假阴性结果[8]。 Tp0453 抗原可能是最具潜力的梅毒血清学诊断候选外膜抗原之一，与其它已知的外膜整合蛋白结构不同， Tp0453 无片层结构，不能穿过外膜形成表面暴露，而是深入胞质中，与其他细菌无同源性，与螺旋体其他菌属也无交叉反应。计算机分析预测Tp0257(Gpd)是一个脂蛋白，用14C标记棕榈酸研究证实了该蛋白是脂修饰的[9]。虽然脂蛋白Gpd较非脂蛋白Tp0155，Tp0483和 Tp0751显示更高的灵敏度，但仍有早期梅毒患者的血清不能和Gpd反应。

在本研究中，我们采用全基因组合成的方法构建重组质粒pET-28a-Tp0453-Tp0257，在Tp0453和Tp0257之间用(GGGGS)3]连接以保证它们各自的柔性。重组质粒pET-28a-Tp0453-Tp0257转化BL21后在IPTG诱导下能够产生可溶的重组融合蛋白Tp0453-Tp0257，SDS-PAGE和Western Blot分析证明Tp0453-Tp0257重组融合蛋白阳性梅毒血清反应。然后以Tp0453-Tp0257重组融合蛋白作为包被抗原制备的ELISA试剂盒对来自梅毒阴性和梅毒感染不同阶段的血清样本进行检测，以评估重组融合蛋白对梅毒的诊断意义。我们的结果表明Tp0453-Tp0257重组融合蛋白对梅毒的总特异性为100%，对一期梅毒的灵敏度为95.0%，对二期、三期和隐性梅毒的灵敏度均为100.0%，对梅毒诊断的总灵敏度为97.8%。国内有多位学者探讨Tp0453作为诊断梅毒的抗原。王宪灵[8]曾对 Tp0453 抗原优势表位区段( 62aa- 224aa) 进行构建表达，发现表达产物与梅毒患者血清具有良好的 ELISA 反应性。张薇[10]也发现一期梅毒中 Tp0453 检出率高于其它各期梅毒。Smith等[2]也证明Tp0453对各期梅毒诊断的灵敏度和特异性分别为98%和99%，但发现被Tp0326、Tp0453和融合蛋白鉴定的三份假阴性标本，TPPA鉴定为阳性。这表明以Tp0453为核心蛋白诊断梅毒也有漏检的可能。我们对来自临床的标本分析表明该重组融合蛋白对梅毒诊断的灵敏度和特异性超过或至少等同目前国内梅毒诊断的商业试剂盒。但我们的研究存在一些缺陷，一是样本量不够大，如果将来用Tp0453-Tp0257重组融合蛋白作为梅毒诊断的抗原，需要大样本进行研究；二是没有比较Tp0453-Tp0257重组融合蛋白和Tp0453蛋白作为梅毒诊断抗原对梅毒诊断的差异。这些是下一步研究的重点。

总之，我们表达纯化了Tp0453-Tp0257重组融合蛋白，对该蛋白用于梅毒的诊断具有很高的特异性和灵敏度，有作为多种梅毒诊断试剂盒用抗原的潜能。

参考文献：

[1]Tucker JD，Yin YP，Wang B，et al.An expanding syphilis epidemic in China：epidemiology，behavioural risk and control strategies with a focus on low-tier female sex workers and men who have sex with men[J].Sex Transm Infect，2011，2(7):16

[2]Smith BC，Yvonne S，Morshed MG，et al.New proteins for a new perspective on syphilis diagnosis[J].J Clin Microbiol，2013，51(1):105

[3]Long FQ，Zhang JP，Shang GD，et al.Seroreactivity and immunogenicity of Tp0965，a hypothetical membrane protein of Treponema pallidum[J].Chin Med J(Engl)，2012，125(11):1920

[4]Ai Hua S，Ya Fei M，Ye H，et al.Sensitive and specific ELISA coated by TpN15-TpN17-TpN47 fusion protein for detection of antibodies to Treponema pallidum.[J].Clin Chem Lab Med，2009，47(3):321

[5]伍宁.梅毒螺旋体部分膜蛋白的研究现状[J].微生物学免疫学进展，2009，37(1)：59

[6]Van Voorhis WC，Barrett LK，Lukehart SA，et al.Serodiagnosis of syphilis：antibodies to recombinant Tp0453，Tp92，and Gpd proteins are sensitive and specific indicators of infection by treponema pallidum[J].J Clin Microbiol，2003，41(8):3668

[7]Brightbill HD，Libraty DH，Krutzik SR，et al.Host defense mechanisms triggered by microbial lipoproteins through Toll-like receptors[J].Science，1999，285(5428):732

[8]王宪灵．重组TP47、TP0453 抗原优势表位区段在梅毒螺旋体感染诊断中的应用研究[D]．重庆：第三军医大学，2008：5

[9]Stebeck CE，Shaffer JM，Arroll TW，et al.Identification of the Treponema pallidum subsp.pallidum glycerophosphodiester phosphodiesterase homologue[J].Fems Microbiol Lett，1997，154(2):303

[10]张薇．Tp0453 Tp17在梅毒患者血清中的表达及相关性研究[D]．四川：泸州医学院，2012：4

(收稿日期：2016-01-07)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.02.0140

中图分类号：R377.1

文献标识码：B

文章编号：2095-4646(2016)02-0140-03

基金项目：深圳市龙华新区科技创新资金“社会公益科研项目”(2013039)；海南省自然科学基金资助项目(811177)。

**通信作者，E-mail:mq69693@126.com