新疆芜菁水提物抗肿瘤活性初步研究

陈卓尔，古娜娜·对山别克，乌　英，侯宝林*，海力茜·陶尔大洪*

(1.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐　830054；2.新疆医科大学第三附属医院药剂科，乌鲁木齐　830000；3.新疆自治区人民医院药学部，乌鲁木齐　830000)



新疆芜菁水提物抗肿瘤活性初步研究

陈卓尔1，古娜娜·对山别克2，乌英3，侯宝林1*，海力茜·陶尔大洪1*

(1.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐830054；2.新疆医科大学第三附属医院药剂科，乌鲁木齐830000；3.新疆自治区人民医院药学部，乌鲁木齐830000)

摘要：目的初步分析新疆芜菁水提物(BAE)对Lewis肿瘤的抑制作用。方法利用小鼠Lewis肿瘤移植模型，测定BAE对荷瘤小鼠的抑瘤率、脾脏指数、生命延长率，并通过体外淋巴细胞转化实验(MTT法)观察对小鼠免疫系统的影响。结果BAE各组瘤质量与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01)，BAE各组脾脏指数与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，BAE各组生存时间与模型组相比差异有统计学意义(P<0.01)，同时初步显示,BAE对小鼠体外淋巴细胞转化也有一定增强作用。结论新疆芜菁水提物(BAE)可以增加抑瘤率、脾脏指数、生命延长率，并初步说明其对小鼠体外淋巴细胞转化也有一定增强作用。

关键词：芜菁；水提物；抗肿瘤

芜菁(Brassica rapa L.)，属于十字花科芸苔属芸苔种，在维吾尔药中，芜菁名为恰麻古，是一种药食兼用植物，临床用于滋阴润肺，平喘、止咳、清除体内异常黏液质等异常体液。近代药理研究发现，芜菁具有止咳、祛痰及平喘[1]的功效。在本课题组之前的研究中[2]，已初步鉴定新疆芜菁水提物(BAE)中含有糖及其苷[3]、黄酮类、氨基酸和蛋白质、皂苷、鞣质和酚类等成分。本文以新疆芜菁为原料，首先对干燥芜菁药材进行水提[4]，得到芜菁水提物(BAE)，进而初步探讨BAE对Lewis肿瘤的体内抑制作用和体外淋巴细胞转化(MTT)[5-6]等生物活性，为今后芜菁药材的利用和开发奠定基础。

1仪器与材料

1.1仪器DK-S24型电热恒温水浴锅，上海精密实验设备有限公司；S54紫外-可见分光光度计，上海分析仪器厂；TDL80-2B离心机，上海安亭科学仪器厂；CJ-2F 型超净工作台 ，苏州市净化设备厂；CO2培养箱，上海一恒实验设备有限公司；EPSON Stylus C65 型酶标仪，爱普生(中国)有限公司；96 孔细胞培养板，美国CORNING 公司。

1.2试药新疆芜菁，购于阿克苏柯坪县，经新疆医科大学药学院生药/天药教研室帕丽达·阿布力孜教授鉴定，为十字花科芸苔属芸苔种芜菁(BrassicarapaL.)地下茎。芜菁水提物(BAE)：实验室自制的水提物；环磷酰胺CTX，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号20090124；刀豆蛋白A(ConA)，美国sigma公司；脂多糖(LPS)，美国sigma公司；噻唑蓝(MTT)，美国Sigma公司；RPMI-1640 培养液，北京天润善达生物科技有限公司。

1.3动物BALB/C小鼠，体质量18～22 g，均为雌性小鼠，由新疆医科大学实验动物中心提供。Lewis细胞株，购于上海生命科学研究院。

2方法

2.1芜菁水提物(BAE)的制备采用水提法提取芜菁，提取工艺为：固液比1∶30(g·mL-1)，提取温度为90 ℃，提取3次，每次2 h。

2.2芜菁水提物抗Lewis肿瘤的实验

2.2.1肿瘤模型的建立及分组取BALB/C小鼠72只，皮肤经消毒后，将0.2 mL Lewis瘤细胞液(瘤细胞悬液细胞数为1×107个·mL-1)注射于每只小鼠右前肢腋下，接种方式为皮下接种。接种24 h后，将小鼠随机分为6组，每组12只，分别为模型组(生理盐水0.02 mL·g-1)、阳性对照组(环磷酰胺，30 mg·kg-1·d-1)、BAE低剂量组(50 mg·kg-1·d-1)、中剂量组(100 mg·kg-1·d-1)、高剂量组(200 mg·kg-1·d-1)、联合治疗组(BAE 200 mg·kg-1·d-1+环磷酰胺组30 mg·kg-1·d-1)。各组小鼠均为灌胃给药，每日1次，连续给药10 d。

2.2.2抑瘤率和脾脏指数的测定小鼠建模、分组及给药方式与2.2.1项下方法相同。停药24 h后，称取小鼠质量，处死，并小心剥离瘤组织，分离脾脏，分别称取质量，并计算脾脏指数[7-8]。抑瘤率=(对照组平均瘤质量-治疗组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量×100%；脾脏指数(mg·g-1)=脾质量/体质量。

2.2.3小鼠存活期与生命延长率的测定小鼠存活期自小鼠接种肿瘤之日开始，到给药组小鼠全部死亡为止，并记录各组小鼠死亡时间，计算小鼠生命延长率。实验动物生命延长率=(给药组平均生存时间-空白组平均生存时间)/空白组平均生存时间×100%。

2.3芜菁水提物对体外淋巴细胞转化功能的影响(MTT法)解剖小鼠，小心剥离小鼠脾脏，研磨并加入RPMI-1640培养液，200目筛网过滤后，离心，稀释后制成1×107个·mL-1单细胞悬液。在超净工作台上，将脾细胞悬液分别加入96孔板中，每孔100 μL，并设置平行孔。按以下要求加样：(1)实验组(ConA)：100 μL脾细胞悬液+50 μL不同质量浓度BAE溶液+50 μL ConA溶液(5 μg· mL-1)+50 μL RPMI-1640培养液。对照组：100 μL脾细胞悬液+50 μL ConA溶液(5 μg·mL-1)+100 μL RPMI-1640培养液。观察T细胞增殖反应。(2)实验组(LPS)：100 μL脾细胞悬液+50 μL不同质量浓度BAE溶液+50 μL LPS溶液(5 μg·mL-1)+50 μL RPMI-1640培养液。对照组：100 μL脾细胞悬液+50 μL LPS溶液(5 μg·mL-1)+100 μL RPMI-1640培养液。观察B细胞增殖反应。BAE质量浓度分别为0.01，0.05，0.25，0.5，0.75和1 mg·mL-1。在37 ℃、5%的CO2培养箱中培养72 h，弃上清液，每孔加入20 μL 5 mg·mL-1的噻唑蓝液，继续培养4 h，弃上清液，加入二甲亚砜150 μL，静置30 min，用振荡器振荡混匀，用酶标仪测定各孔A570值。

3结果

3.1荷瘤小鼠抑瘤率和脾脏指数除模型组外，其他各组小鼠瘤质量均减小，肿瘤均被明显抑制，并且在BAE各剂量组中抑瘤效果与剂量呈正相关。BAE各剂量组小鼠脾脏指数较模型组显著提高，差异具有统计学意义(P<0.05)。而CTX组脾脏指数小于模型组，可能由于CTX作为一种化疗药物，具有较强的免疫抑制功能，对小鼠脾脏有严重的毒性和不良反应，抑制脾脏生长。联合治疗组脾脏指数大于CTX组，但小于BAE各剂量组，说明多糖在改善荷瘤小鼠免疫功能的同时，可以降低CTX对脾脏造成的损伤。见表1。

表16组荷瘤小鼠肿瘤抑制率及脾脏指数测定结果

Tab.1 The effect of BAE on tumor inhibition ratio and spleen index in the 6 groups of turnor-bearing mice

±s)

注：**P<0.01，差异有统计学意义；*P<0.05，差异有统计学意义。

3.2荷瘤小鼠存活时间及生命延长率给药组小鼠生存时间增加，与模型组相比，差异均有统计学意义(P<0.01)。BAE各剂量组小鼠生存时间低于CTX组。联合治疗组小鼠生存时间最长，生命延长率达到78.1 %。见表2。

3.3荷瘤小鼠脾淋巴细胞功能当BAE质量浓度为0.5，0.75和1 mg·mL-1时，实验组(加ConA)A值与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，初步说明其可以诱导T淋巴细胞增殖。当BAE质量浓度为0.25，0.5，0.75和1 mg·mL-1时，实验组(加LPS)A值与对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，初步说明可以诱导B淋巴细胞增殖。见表3。

表26组荷瘤小鼠存活时间及生命延长率测定结果

Tab.2 The effect of BAE on survival times and extension ratio of life span in the 6 groups of turnor-bearing mice

±s， n=12)

表36组小鼠脾淋巴细胞转化功能测定结果

Tab.3 The effect of BAE on splenic lymphocyte transformation in the 6 groups of turnor-bearing mice

±s， n=12)

注：**P<0.01，差异具有统计学意义；*P<0.05，差异具有统计学意义。

4讨论

本实验采用了Lewis移植性肿瘤模型进行了BAE体内抗肿瘤的初步研究。BAE与环磷酰胺联合治疗组小鼠肿瘤被明显抑制，瘤质量减小，抑瘤效果很好，生命延长率增加，并且脾脏指数较阳性对照组有较明显的增加，说明BAE能明显地改善环磷酰胺造成的免疫低下，同时，对荷瘤小鼠的免疫器官有一定的保护作用。提示BAE可以作为环磷酰胺的辅助药物，减轻传统化学药物的不良反应，减轻患者的痛苦，一定程度延长其生命。另外，BAE与环磷酰胺的作用机制不尽相同，环磷酰胺有免疫抑制作用，所以BAE不能与环磷酰胺同时给药。本实验过程中两者的给药时间间隔初步设定为3 h。

脾脏是机体最大的免疫器官，主要功能是参与免疫反应，并且含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，是机体细胞免疫和体液免疫的中心。脾细胞增殖是反映细胞免疫最直接的指标，T淋巴细胞和B淋巴细胞受到抗原物质刺激后能分裂增殖、发生特异性免疫应答、产生抗体或淋巴因子。用药物刺激淋巴细胞的增殖，检测药物对T、B细胞功能的影响是探讨药物抗肿瘤作用机制和筛选其活性强弱的首要方法。本研

究结果显示，与模型组相比，BAE各剂量组均能够抑制荷瘤小鼠肿瘤，而BAE在0.5～1 mg·mL-1的范围内，可以同时诱导T、B细胞增殖，说明BAE有脾淋巴细胞转化能力，进而具有抗肿瘤活性。提示BAE抗肿瘤作用机制之一是通过活化T、B淋巴细胞增强而发挥作用。

本实验针对芜菁水提物抗肿瘤活性的初步研究，水提物具体组成未知，仅在本课题组之前的研究中发现，水提物中总多糖含量超过10%，其余组分有待进一步研究其起效成分和作用机制，拟通过分离纯化确定其中主要作用的1种或几种成分。

参考文献：

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[2]旷南岳，海力茜·陶尔大洪. 维药恰麻古儿药材质量标准的研究[J]. 西北药学杂志. 2010，25(6):421-423.

[3]王菁，白晓光，海力茜·陶尔大洪. 新疆芜菁中硫代葡萄糖苷提取工艺条件的优化[J]. 西北药学杂志. 2013， 28(3):237-239.

[4]侯宝林，王茜，海力茜·陶尔大洪.维药恰麻古儿多糖提取工艺研究及含量测定[J].时珍国医国药.2009，20(11): 2759-2761.

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[6]张龙涛，王舒宁，龚晖，等. 姬松茸液体发酵各组分多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响[J]. 福建农林大学学报: 自然科学版， 2007， 36(1): 72-76.

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[8]王雪，邹向阳，郭莲英，等. 裙带菜多糖抗肿瘤作用的研究[J]. 大连医科大学学报，2006，28(2): 98-100.

Study on the anti-tumor effect of aqueous extract fromBrassicarapaL.

CHEN Zhuoer1， Gunana DUISHANBIEKE2， WU Ying3， HOU Baolin1*， Hailiqian TAOERDAHONG1*

(1. College of Pharmacy， Xinjiang Medical University， Urumqi 830054， China； 2. Department of Pharmacy， the Third Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University ，Urumqi 830000， China； 3. Department of Pharmacy， the People′s Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Urumqi 830000， China)

Abstract:ObjectiveTo explore the inhibitory action of aqueous extract from Brassica rapa L.(BAE) on the transplantable cancer mice.MethodsThe anti-tumor effects of BAE were tested in mice with transplanted tumorsarcom Lewis. The tumor inhibition rate， life span， spleen index and the lymphocyte transformation function in vitro were evaluated. ResultsThe tumor weight of BAE groups showed statistical significance compared with that of NS group (P<0.01)， the spleen index of BAE groups had statistical significance compared with that of NS group (P<0.05)， and survival days of polysaccharides groups demonstrated statistical significance compared with that of NS group (P<0.01). Furthermore， it was shown that lymphocyte transformation function in vitro could be enhanced by BAE.ConclusionThe tumor inhibitory rate， the spleen index and life prolonging rate could be increased by BAE. In addition， the preliminary results show that lymphocyte transformation function in vitro could be enhanced by BAE.

Key words:Brassica rapa L.；aqueous extracts； anti-tumor

(收稿日期：2015-10-10)

中图分类号：R965

文献标志码：

文章编号：1004-2407(2016)03-0264-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.013

作者简介：陈卓尔，女，硕士研究生

基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：81460615)；新疆地方病分子生物学重点实验室开放课题项目(编号：XJDX0208-2012)

*共同通信作者：侯宝林，男，硕士研究生

海力茜·陶尔大洪，女，教授