UPLC法快速测定栀子复方制剂中栀子苷和西红花苷-1含量

彭小芳，郝　顺，林　严，莫镇涛，陈　阳，李文娜

(遵义医学院珠海校区药理教研室，珠海　519041)



·药物分析·

UPLC法快速测定栀子复方制剂中栀子苷和西红花苷-1含量

彭小芳，郝顺，林严，莫镇涛，陈阳，李文娜*

(遵义医学院珠海校区药理教研室，珠海519041)

摘要：目的建立快速测定栀子复方制剂复方牛黄消炎胶囊、清胃黄连丸和龙泽熊胆胶囊中栀子苷和西红花苷-1的方法。方法采用UPLC法。色谱柱为 BEH C18柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相：甲醇-水以不同梯度洗脱；流速：0.3 mL·min-1；检测波长：0～7 min为238 nm，7～20 min为440 nm；柱温：30 ℃；进样量为2 μL。结果3种复方制剂中栀子苷在0.010～1.000 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系(r=0.999 9)，平均回收率分别为98.2%，99.9%和100.3%，RSD分别为1.3%，1.4%和1.0%；西红花苷-1在0.1～10.0 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系(r=0.999 9)。平均回收率分别为99.6%，97.4%和98.3%，RSD分别为1.3%，1.4%和1.5%。结论栀子苷和西红花苷-1在20 min内获得良好分离，该方法简便、准确、快速，可用于栀子复方制剂中栀子苷和西红花苷-1的测定。

关键词：栀子苷；西红花苷-1；栀子复方制剂；超高效液相色谱法

栀子来源于茜草科植物栀子的药用果实，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒的功效。栀子苷和西红花苷是栀子的主要化学成分[1]。栀子苷具有抗炎、利胆等作用[2-3]；西红花苷在抗炎、防治心血管疾病等方面具有明确的药理作用[4-5]。龙泽熊胆胶囊(含有龙胆、地黄、栀子、黄连、大黄等17味中药)有清热散风、止痛退翳之功效；复方牛黄消炎胶囊(含有人工牛黄、栀子、珍珠母等11味中药)具有清热解毒、镇静安神的功效；清胃黄连丸(含有黄连、地黄、知母、栀子等14味中药)具有清胃泻火、解毒消肿之功效。《中国药典》2010年版规定龙泽熊胆胶囊以龙胆苦苷为检测标准；复方牛黄消炎胶囊和清胃黄连丸均以检测盐酸小檗碱为检测标准[6]。栀子也是3种中成药的重要组分之一，其有效成分(栀子苷和西红花苷)的含量可直接影响药物的药效，现行药典采用HPLC法测

定栀子苷的含量而未检测西红花苷的含量。因此，本文采用UPLC法同时测定3种中成药中栀子苷和西红花苷-1的含量，为补充、完善含有栀子苷和西红花苷的中成药质量控制标准提供依据。

1仪器与试药

1.1仪器 超高效液相色谱仪(美国Waters公司，配有Waters Acquity UPLC BEH Shield RP C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色谱柱、四元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、Empower 3色谱工作站)。KQ3200超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XS 205电子天平(METTLER TOLEDO仪器有限公司)。

1.2试药 栀子苷对照品(西安开来生物工程有限公司，批号K130116)；西红花苷-1(crocin-1)为本实验室自制[7]。龙泽熊胆胶囊(吉林真元制药有限公司，批号20130101)；复方牛黄消炎胶囊(云南白药集团股份有限公司，批号WLE 12003)；清胃黄连丸 (山西华康药业股份有限公司，批号20140301)。甲醇为色谱纯(Merck)；水为蒸馏水；其余试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1溶液的制备2.1.1对照品溶液的制备精密称取对照品栀子苷和西红花苷-1适量，分别加体积分数为50%的甲醇配制成1.000 0 mg·mL-1的栀子苷和10.0 μg·mL-1的西红花苷-1混合对照品溶液。

2.1.2供试品溶液的制备成药分别研碎，精密称定0.1 g，置于10 mL量瓶中，加入体积分数为50%的甲醇溶液，超声提取20 min，取出，定容至刻度。振摇均匀，取液层，以8 000 r·min-1离心10 min，上清液用0.22 μm的滤膜过滤后作为供试品溶液。

2.2色谱条件C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色谱柱。流动相为水(A)-甲醇(B)梯度洗脱(0～5 min，90%～82%A；5～13.3 min，82%～62%A；13.3～16.7 min，62%～50%A；16.7～19 min，50%～90%A)。流速：0.3 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：0～7 min，238 nm；7～20 min，440 nm；进样量：2 μL。对照品及样品色谱图见图1。

图1UPLC图

A.栀子苷、 西红花甘-1混合对照品; B.复方牛黄消炎胶囊; C.清胃黄连丸; D.龙泽熊胆胶囊; 1.栀子苷;2.西红花苷-1

Fig.1 UPLC chromatograms

A.the standard products of geniposide and crocin-1;B.Niuhuangxiaoyan Capsules;C.Qingweihuanglian Pills;D.Longzexiongdan Capsules; 1. geniposide;2. crocin-1

2.3方法学考察

2.3.1线性考察实验取2.1.1项下的栀子苷和西红花苷-1对照品混合液0.5，1，2，4和8 mL，置于10 mL量瓶中，加体积分数为50%的甲醇稀释至刻度，精确吸取2 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。以栀子苷质量浓度(mg·mL-1)和西红花苷-1质量浓度(μg·mL-1)为横坐标、记录峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，经线性回归，得栀子苷线性方程：Y=3 227.430 3X+2 307.3，r1=0.999 9；得西红花苷-1线性方程：Y=73 813X+757，r2=0.999 9。表明栀子苷和西红花苷-1分别在0.010～1.000 mg·mL-1和0.1～10.0 μg·mL-1范围内线性关系良好。

2.3.2精密度实验精密吸取对照品混合溶液2 μL，按照2.2项下色谱条件，连续进样6次，测定栀子苷和西红花苷-1峰面积， RSD值分别为1.13%和1.01%，表明仪器精密度良好[8]。

2.3.3稳定性实验按照2.2项下色谱条件，分别在0.5，1，3，6和12 h精密吸取同一批次供试品溶液，测定栀子苷和西红花苷-1的峰面积，计算RSD分别为2.12%和1.76%。表明样品溶液在12 h内稳定[9]。

2.3.4重复性实验按照2.2项下色谱条件，精密吸取 2.1.2项下制备的供试液6份，分别测定记录峰面积，栀子苷峰面积RSD为1.68%(n=6)；西红花苷-1峰面积RSD为1.34%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.3.5加样回收率实验精密吸取已知含量的3种样品液，分别加入一定量的栀子苷和西红花苷-1对照品溶液，按照2.1.2项下方法制备供试品溶液，按照2.2项下的色谱条件测定含量，平行测定6份，计算加样回收率。栀子苷在复方牛黄消炎胶囊、清胃黄连丸、龙泽熊胆胶囊的平均回收率分别为98.2%，99.9%和100.3%，RSD均小于2%(n=6)，见表1；西红花苷-1的平均回收率分别为99.6%，97.4%和98.3%，RSD均小于2% (n=6)，见表2。

表1栀子苷加样回收率实验结果

Tab.1 Results of recovery tests for geniposide

药品称样量/g样品中量/μg添加量/μg测出量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%复方牛黄消炎胶囊0.1172.1170.0330.196.598.21.30.1169.5170.0334.198.40.1171.3170.0331.797.20.1170.4170.0337.799.20.1169.6170.0339.399.90.1168.0170.0331.298.0清胃黄连丸0.1866.4867.01764.6101.899.91.40.1868.7867.01747.8100.70.1867.6867.01720.799.20.1865.3867.01742.7100.60.1867.1867.01718.599.10.1866.9867.01697.597.9龙泽熊胆胶囊0.1190.2191.0378.599.3100.31.00.1190.8191.0381.099.80.1191.2191.0385.3100.80.1190.1191.0386.1101.30.1191.9191.0379.599.10.1191.8191.0388.5101.5

表2西红花苷-1加样回收率实验结果

Tab.2 Results of recovery tests for crocin-1

药品称样量/g样品中量/μg添加量/μg测出量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%复方牛黄消炎胶囊清胃黄连丸龙泽熊胆胶囊0.12.15.07.14100.699.61.30.12.35.07.31100.10.12.05.06.8898.10.12.45.07.3399.00.11.95.06.8098.60.12.55.07.61101.40.112.112.023.8098.997.41.40.112.212.023.7098.00.112.712.023.7096.00.112.612.024.3098.80.112.312.023.3095.90.112.512.023.7096.80.10.010.09.8899.998.31.50.10.010.09.9099.00.10.010.09.7597.10.10.010.09.8497.20.10.010.09.8299.80.10.010.09.7896.7

2.4含量测定

供试品的含量测定在2.2项色谱条件下，取2.1.2项下制备的供试品溶液3份进行分析，测定含量。复方牛黄消炎胶囊、清胃黄连丸和龙泽熊胆胶囊UPLC含量测定中，栀子苷平均含量分别为0.170%，0.867%和0.191%；复方牛黄消炎胶囊和清胃黄连丸中西红花苷-1的平均含量分别为0.002 2%和0.012 4%；龙泽熊胆胶囊未检出西红花苷-1。结果见表3。

表3样品测定结果

Tab.3 The content of geniposide and crocin-1 in different samples

(n=3)

3讨论

栀子不同的炮制方法呈现出不同疗效，药用成分也相应地发生变化[10-13]。栀子苷是一种环烯醚萜葡萄糖苷[14]，具有抗炎、解热、利胆和轻泻作用，是抗炎和治疗软组织损伤的主要成分。现行标准对栀子药材和含有栀子药材的部分中药复方采取测定栀子苷的含量作为质量标准，但都没有西红花苷-1含量测定的规定，而中成药中栀子苷和西红花苷-1含量的高低可能会对成药的疗效产生一定影响。复方牛黄消炎胶囊、清胃黄连丸和龙泽熊胆胶囊均对呼吸道炎症具有良好的疗效。西红花苷也是栀子药材的主要成分和发挥各种药理活性的物质基础，西红花苷具有明显的抗炎作用。Xu等[15]研究表明，西红花苷对CXO-1、COX-2酶具有双重抑制作用。能剂量依赖性抑制二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀，明显抑制对吲哚美辛诱导的大鼠胃炎模型中的胃病病损的进展。药理研究显示，西红花苷还具有保护心血管系统、抑制肿瘤细胞增殖、神经保护和保护肝脏等作用[16-18]。因此，本实验同时测定了栀子中栀子苷和西红花苷中含量最高的西红花苷-1(含量约为栀子药材中总西红花苷的87%)的含量，有利于更全面反映含栀子复方制剂的内在品质。

本实验建立了20 min内快速鉴定并测定3种含栀子复方制剂中西红花苷-1和栀子苷的方法。方法学研究表明，本方法准确、简便、快速，可作为栀子复方制剂中栀子苷和西红花苷的含量测定方法。

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Simultaneous determination of crocin-1 and geniposide in Zhizi preparations by UPLC

PENG Xiaofang， HAO Shun， LIN Yan， MO Zhentao， CHEN Yang， LI Wenna*

(Department of Pharmacology， Zunyi Medical College， Zhuhai Campus， Zhuhai 519041， China)

Abstract:ObjectiveTo establish a fast method for simultaneous determination of geniposide and crocin-1 in three kinds of traditional Chinese medicines by UPLC. MethodsUPLC was adopted in this study. The analytical column was BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm) and gradient elution with methanol-H2O as mobile phase. The flow rate was 0.3 mL·min-1. The detection wavelength was set at 238 nm (0-7 min) for geniposide and 440 nm (7-20 min) for crocin-1. The column temperature was 30 ℃and the injection volume was 2 μL. ResultsThe two components had a good linear relationship between 0.010-1.000 mg·mL-1and 0.1-10.0 μg·mL-1. The average recoveries (n=6) of geniposide and crocin-1 in three preparations were 98.2%，99.9% and 100.3% (RSD 1.3%，1.4% and 1.0%) and 99.6%，97.4% and 98.3% (RSD 1.3%，1.4% and 1.5%)， respectively. ConclusionThe separation of geniposide and crocin-1 only needs 20 min with accuracy and good reliability. The method is simple，specific and suitable for the simultaneous determination of the content of geniposide and crocin-1 in the three preparations.

Key words:geniposide;crocin-1; Zhizi preparation; UPLC

(收稿日期：2015-06-23)

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1004-2407(2016)03-0245-04

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.007

*通信作者：李文娜，女，博士，硕士研究生导师

作者简介：彭小芳，男，硕士研究生

基金项目：贵州省中药现代化研究开发专项项目(编号：黔科合ZY字[2013]3018号)