用酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒CP互作的寄主因子

戚文平，刘丽娟，李 宇，孙炳剑，李洪连

(河南农业大学植物保护学院, 河南郑州 450002)



用酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒CP互作的寄主因子

戚文平，刘丽娟，李 宇，孙炳剑，李洪连

(河南农业大学植物保护学院, 河南郑州 450002)

摘要：为筛选与小麦黄花叶病毒外壳蛋白(wheat yellow mosaic virus coat protein， WYMV-CP)互作的小麦蛋白，构建了小麦茎叶酵母双杂交cDNA文库，并从中筛选获得了与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段。从小麦茎叶中提取小麦总RNA,分离mRNA后，利用GATE-WAY技术将反转录得到的小麦cDNA片段定向转移到目的载体，同源重组反应后成功构建小麦cDNA文库。经检测，小麦cDNA文库的滴度为5.86×106 CFU·mL-1,库容量为2.34×107 CFU,重组率为95.8%。根据NCBI上WYMV-CP开放阅读框信息，构建了诱饵载体pGBK-CP，通过酵母双杂交筛选获得了若干阳性克隆，共转化试验初步验证了WYMV-CP与PEPCK、PAL等蛋白的互作关系。本研究利用酵母双杂交技术成功获得与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段，为明确WYMV的致病机制提供了科学的依据。

关键词：小麦黄花叶病毒；外壳蛋白；cDNA文库；酵母双杂交

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)成员之一[1]，由土壤中禾谷多黏菌(PolymyxagraminisL.)进行传播。在我国江苏、河南、安徽、山东、陕西、湖北和四川等省均有分布，近年来，每年全国冬麦区发病面积超过50万hm2，并呈逐年蔓延趋势[2]。

酵母双杂交技术作为快速检测和鉴定蛋白质相互关系的标准方法之一，已经被广泛应用于各类生物的蛋白质互作的研究[3-4]。小麦黄花叶病毒外壳蛋白(Coat protein，CP)是病毒唯一的结构蛋白，也是病毒最重要的致病因子，在病毒的侵染过程中扮演多种角色。CP携带着与介体和寄主的识别信息，主要功能是包装病毒粒子、参与介体传播、病毒与寄主和介体识别、调节RNA复制、细胞间运动和系统侵染，尤其是对病毒侵染症状起决定作用。Li等[5]以番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)外壳蛋白为诱饵，利用酵母双杂技术筛选烟草cDNA文库，分离出一个激发子蛋白，该蛋白基因被沉默后，病毒粒子不能长距离运动，证实了该蛋白和病毒外壳蛋白互作有利于病毒运动。Okinaka等[6]利用酵母双杂交技术，以雀麦花叶病毒(Brome mosaic virus, BMV)CP为诱饵，筛选大麦cDNA文库，得到一个氧化还原酶基因HCP1。目前，国内外关于WYMV-CP与寄主蛋白互作方面的研究较少[7-9]。本研究利用酵母双杂交技术，从构建的小麦cDNA文库中筛选出与WYMV-CP互作的寄主蛋白，以期为小麦黄花叶病毒的致病机制研究提供科学的依据。

1材料与方法

1.1试验材料

供试材料为小麦品种中国春，于植株苗期自河南农业大学科教园区实验田采集，蒸馏水清洗干净，保存于-80℃冰箱备用。

大肠杆菌(Escherichiacoli)DH10B、DH5α购自北京全式金生物公司；CP抗血清由浙江省农科院病毒与生物技术研究所陈剑平实验室惠赠。

1.2方 法

1.2.1小麦cDNA文库的构建

文库构建参照Clontech Mate & PlateTM Library Construction方法进行。采用Trizol法[10]提取小麦总RNA, 溶解于50 μL RNase-free H2O后，用超微量分光光度计测量RNA样品的纯度和浓度。参照Fast Track MAG mRNA Isolation Kit说明书分离纯化获得的mRNA；反转录合成cDNA。初级文库的构建参照CloneMiner的说明书进行操作。提取初级文库质粒稀释到300 ng·μL-1, 进行LR重组反应到酵母双杂交载体pGADT7-DEST上，电转化于DH10B感受态细胞，获得酵母双杂交cDNA文库。

文库质量鉴定：取转化后细菌原液10 μL稀释1 000倍后，吸取50 μL涂布于LB平板(Amp+)，第二天计数、检查库容量(平板上的克隆数/50×1 000×1×103×文库菌液总体积)。从中随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定，确定重组率和插入片段大小。

提取文库质粒，转化于酵母Y187感受态细胞中，获得可以用于有性杂交的酵母文库，1 mL分管装备用。

1.2.2重组诱饵质粒载体pGBKT7-CP的构建

根据WYMV-CP序列(GenBank：AJ131981)设计特异性引物CP-F:5′-GCATATGGCAGCT GACACACAAACAGA-3′, CP-R:5′-TAGATC TTTAGGTTAGTTCTGGGTGTCC-3′；以反转录小麦黄花叶病毒cDNA为模板扩增；扩增产物连接到载体pMD18-T后,转化于感受态细胞DH5α中，提取阳性克隆质粒。利用NdeI和BglII双酶切重组质粒 pMD18-CP，用NdeI和BamHII双酶切pGBKT7质粒。酶切产物在T4连接酶作用下4℃连接过夜，转化于感受态DH5α中，筛选阳性克隆并送上海生工生物公司测序。

将空载体pGBKT7和重组质粒pGBK-CP分别转入Y2H Gold酵母感受态细胞，涂布在SD(-Trp)和SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-GAL)两种固体平板，30 ℃孵育2～3 d，观察菌落形态及颜色，以此判断诱饵质粒是否对酵母菌株有自激活活性和毒性。SDS/尿素法提取酵母蛋白(按照Clontech：Yeast Protocols Handbook操作说明书进行操作)，以抗C-myc标签兔多克隆抗体为一抗、HRP标记山羊抗兔多克隆抗体为二抗，对酵母蛋白进行WESTERN BLOT实验。

1.2.3小麦cDNA文库筛选

参照Clontech MatchmakerTM Gold Yeast Two-Hybrid System User Manual方法进行，并稍做改进。从SD(-Trp)平板上挑取新鲜菌落，于50 mL SD(-Trp)液体培养基，30 ℃摇菌过夜，至OD600超过0.8。离心，弃上清，用SD(-Trp)液体培养基3 mL重悬浮。加入1 mL转入了酵母Y187的cDNA文库，混匀于45 mL的YPDA(含50 μg·mL-1Kan+)液体培养基中，30 ℃、40 r·min-1孵育20～24 h。离心，弃上清，用0.9%NaCL重悬。涂布于SD(-Trp/-Leu/-His)营养缺陷型培养基上，30 ℃孵育2～3 d，将单克隆划线于SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-GAL)平板上，30 ℃孵育2～3 d。提取阳性克隆的质粒，转化入感受态DH5a，筛选阳性克隆送上海生工生物公司进行测序。将测序结果在NCBI上进行Blast比对。

将测序正确的质粒分别和pGBK-CP、pGBK-Lam共转化入酵母感受态细胞，涂布于SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-GAL)固体平板，验证互作结果。

2结果与分析

2.1小麦cDNA的构建及鉴定

利用超微量分光光度计测定小麦总RNA及mRNA的D260、D280、D260/D280和浓度发现，小麦样品总RNA的D260/D280为1.801 6，质量浓度为1.375 μg·μL-1；mRNA的D260/D280为1.973 3，质量浓度为0.975 μg·μL-1。1%琼脂糖凝胶电泳检测结果(图1)显示，抽提的RNA样品质量较好，没有发生明显的降解。mRNA有一条弥散的带，说明mRNA分离纯化效果较好。获得的RNA和mRNA完整性良好，可用于后续试验。

M:1 kb DNA marker

试验得到的cDNA文库的滴度为5.86×106CFU·mL-1, 库容量为2.34×107CFU，重组率为95.8%，成功构建了可以用于酵母双杂交的cDNA文库。挑取24个单克隆进行PCR检测(图2), 发现只有一个克隆插入了较小基因片段(小于1 kb)。

M:1 kb DNA对照；1～24:重组子　　　　M:1 kb DNA marker; 1-24:Recombinants

2.2诱饵载体的构建

目的片段连接到载体pMD18-T，经NdeI和BglII双酶切重组质粒后，用T4连接酶连接到载体pGBKT7，获得了插入目的片段的诱饵载体pGBK-CP。测序结果显示，重组载体读码框正确，无移码突变。将载体pGBK-CP、pGBKT7转入酵母Y2H Gold，转化菌落可以在SD(-Trp)上产生白色菌落，且与对照相比，生长速度无明显差别，但在SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-a-GAL)上均不能生长(图3)。经Western检测，诱饵载体能够在酵母中正常表达(图4)。这些结果说明诱饵载体没有毒性和自激活活性，可以用于下一步筛选试验。

A、C：携带pGBKT7的酵母在SD(-Trp)、SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-a-GAL)平板上；B、D:携带pGBK-CP的酵母在SD(-Trp)、SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-a-GAL)平板上

A,C：Yeast with pGBKT7 on the SD(-Trp) and SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-a-GAL) plate; B,D:Yeast with pGBK-CP on the SD(-Trp) and SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-a-GAL) plate

图3pGBK-CP、pGBKT7载体自激活及毒性验证

Fig.3Autoactivation and toxicity testing

of pGBK-CP、pGBKT7

图4　　　pGBK-CP、pGBKT7载体在酵母中的表达

2.3与WYMV-CP互作寄主因子的筛选

诱饵载体筛选酵母文库，从SD(-Trp/-Leu/-Ade/-His/ABA/X-α-GAL)固体培养基上筛选与WYMV CP互作蛋白。结果，共筛选到29个阳性克隆，通过NCBI比对发现，25个克隆读码框正确，其中4个克隆为磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)基因片段，1个克隆为苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase ，PAL)基因片段，1个克隆为叶绿体依赖ATP的FTSH 2蛋白酶(ATP-dependent zinc metalloprotease FTSH 2, chloroplastic)基因片段，3个克隆为TaENO-b烯醇激酶(TaENO-b enolase)基因片段，其余为未知功能的小麦基因片段。

3讨 论

蛋白质互作是目前生命科学研究的热点，通过构建的cDNA文库来筛选与动植物或病原体某个基因编码的蛋白相互作用的寄主蛋白，是研究蛋白互作的有效手段。黄大辉等[11]系统阐述了利用酵母双杂交技术来筛选与病毒蛋白相互作用的植物蛋白的研究进展。本研究利用GATE-WAY克隆技术构建了小麦的cDNA文库，能够最大限度的保证文库容量，并且操作简单，应用范围广，既提高了灵活性，又简化了克隆工作流程[12]。

病毒在侵染植物过程中，其编码的蛋白会与植物蛋白发生相互作用，以调控植物代谢及病毒侵染过程。Xie等[13]利用酵母双杂交技术，以小麦矮缩双生病毒(Wheat dwarf virus，WDV)复制酶A蛋白为诱饵，从小麦cDNA文库中分离出一个名为GRAB的蛋白质家族，并对其中的两个成员进行了分子特征及功能分析，研究表明GRAB的表达能够抑制病毒在小麦中的复制。病毒外壳蛋白通过与寄主蛋白相互作用影响病毒侵染、症状的产生及其在植物中的运动。目前国内外关于小麦黄花叶病毒和寄主小麦之间的互作机制，尤其是对两者蛋白之间互作的研究报道较少。本研究将小麦黄花叶病毒CP基因构建到诱饵载体上，对小麦cDNA文库进行筛选，初步得到几个有进一步研究意义的蛋白-磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸羧激酶(PEPCK)、苯丙氨酸解氨酶蛋白(PAL) 、TaENO-b烯醇激酶，这三个蛋白都与小麦的抗性有关。PEPCK为钙依赖蛋白，催化底物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸化，为植物中最小的蛋白激酶，像植物中其他激酶一样存在一个催化结构域，但是缺少和钙结合的EF框架[14]。PAL在植物体内的主要作用是催化L-苯丙氨酸转化为肉桂酸。Eck等[15]利用病毒介导的基因沉默技术(VIGS)将小麦PAL基因沉默后，小麦对蚜虫的抗性明显增强。叶绿体依赖ATP的FTSH 2蛋白酶可能影响叶绿体中叶绿素的合成，进而使小麦表现黄化症状。病毒外壳蛋白和这些代谢酶的相互作用，可能影响植物的营养代谢，使植物对病毒的抗性减弱。确定互作关系后，还需对小麦不同生长期这几种小麦蛋白表达量的差异、蛋白的功能及蛋白与病毒互作对植物代谢和病毒侵染的影响进行研究，以更全面的了解病毒危害机理、制定控制措施。本研究发现的病毒CP和PEPCK、PAL等基因的互作现象，为进一步研究小麦黄花叶病毒外壳蛋白和寄主之间的分子作用机制提供了科学的依据。同时，本文构建的小麦全株cDNA文库，也为病原体编码蛋白与寄主小麦互作的研究奠定了基础。

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Screening of Host Factors Interacting with Wheat Yellow Mosaic Virus CP by Yeast Two-hybrid System

QI Wenping,LIU Lijuan,LI Yu,SUN Bingjian,LI Honglian

(College of Plant Protection, Henan Agricultural University, Zhengzhou,Henan 450002,China)

Abstract:In order to screen the wheat proteins which interact with the coat protein of wheat yellow mosaic virus, wheat cDNA library was constructed. And some wheat genes were screened from the cDNA library. After the separation of mRNA from wheat leaf and stem, the wheat cDNA fragments were directional transferred to the purpose vector using the GATE-WAY technology. Following the homologous recombination reaction, the wheat yeast two hybrid cDNA library was constructed. According to the open reading frame information of wheat yellow mosaic virus coat protein in NCBI, the bait vector pGBK-CP was constructed, and wheat protein genes interacting with wheat yellow mosaic virus coat protein were screened by yeast two-hybrid system, which were tested using co-transformation technology. After the detection, the titer of yeast two-hybrid cDNA library is 5.86×106 CFU·mL-1, and the capacity is 2.34×107 CFU, and recombination rate is 95.8%, which can be used in the yeast two-hybrid system. Several positive clones were obtained by the yeast two-hybrid screening, and the interaction relationship between wheat yellow mosaic virus coat protein and PEPCK, PAL proteins were confirmed through co-transformation test. This study provides more theory for explore WYMV pathogenic mechanism on the molecular level.

Key words:Wheat yellow mosaic virus; Coat protein; cDNA library; Yeast two-hybrid

中图分类号：S512.1；S330

文献标识码：A

文章编号：1009-1041(2016)04-0415-05

通讯作者：孙炳剑(E-mail:sbj8624@sina.com)

基金项目：NSFC-河南人才培养联合基金项目(U1304322)；国家公益性行业(农业)科研专项(201303021)

收稿日期：2015-11-30修回日期：2015-12-16

网络出版时间：2016-04-01

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160401.1529.008.html

第一作者E-mail：15517127870@163.com