茶树根际促生菌的筛选与促生特性的研究

韩丽珍，邓兆辉，朱春艳，梁彩娇，韦德萍

(贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025)



茶树根际促生菌的筛选与促生特性的研究

韩丽珍*，邓兆辉，朱春艳，梁彩娇，韦德萍

(贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

摘要：从贵州地区的茶树根际土壤中分离筛选出6株根际促生菌,经16S rRNA基因分子鉴定，它们分属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、束村氏菌属(Tsukamurella sp.)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp.)和根瘤菌属(Rhizobium sp.)中。促生特性的研究结果显示，溶磷解钾性能最优的菌株为GD-3菌株，固氮效能最高的KKS-6-N1菌株，此外6个菌株具有溶磷解钾固氮、产IAA、产NH3、产HCN能力、可分泌嗜铁素及具有ACC脱氨酶活性等多种促生性能，可作为研制微生物肥料的优良菌株资源。

关键词：茶树；根际促生菌；促生特性

植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)是指定植于植物根部系统并能促进植物生长的细菌。其促生机制主要包括：(1)细菌通过固氮酶的作用固定空气中的氮气，为植物提供氮素营养；(2)分泌有机酸，加速土壤中无效磷及难溶性钾的释放，从而增加土壤中游离P、K离子的含量，为植物提供营养；(3)分泌植物激素，如吲哚乙酸(IAA)、细胞分裂素、赤霉素等，以促进植物生长发育；(4)分泌嗜铁素，不仅可与植物根际病原菌争夺有限的铁，抑制病原微生物生长繁殖而起生物防治作用；而且能与土壤中的Fe3+螯合形成复合体后被植物吸收，改善植物的铁营养[1-2]； (5)具有ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)脱氨酶活性，通过将植物乙烯的合成前体ACC分解成丁酮酸和氨来降低乙烯水平，从而增加植物抗逆能力[3-5]；(6)通过竞争生态位，产生抗生素、氢氰酸(HCN)等物质，对植物病原菌具有抑制作用；(7)诱导系统抗性(ISR)等[6]。多年来，研究者在水稻、甘蔗、玉米、小麦、高粱等作物和一些牧草上分离获得很多PGPR菌株，对其固氮、溶磷、产生植物激素和抑病机理、菌肥研制等方面进行了有益的探索[7]，而在茶树等经济林木中的研究鲜有报道[8]。

贵州作为茶叶大省之一，迄止2011年茶种植面积为24.5万hm2，位居全国第二位[9]。到2014年底，全省茶园面积已达44.1万hm2，连续两年排名全国第一[10]。近年来，贵州茶园氮磷流失及土壤酸化、土壤普遍缺磷缺钾状况明显，有效磷和有效钾的含量处于缺乏或很缺乏的均占到40%以上[11-15]。土壤中氮磷钾含量对茶树生长及茶叶的产量品质均有较大影响。因此，本文拟从贵州茶园根际土壤中分离、筛选出具有促生性能的菌株进行研究，研究结果不仅可丰富植物促生菌资源，且可为茶树微生物菌肥的研制及提高茶叶品质产量奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1土样采集

3份土壤样本来源于贵州省遵义市宽阔水自然保护区茶园(107°9′E，28°13′N)，分别标为KKS-6、KKS-7及HSD6，该茶园种植茶树约20-30年茶龄；1份土壤样本采集自贵州大学茶园(106°32′E，26°17′N)，标为GD，茶树茶龄约10年。分别取茶树根际土壤装入标本袋中、置于4℃冰箱保存备用。

1.1.2培养基

解钾菌筛选及活性测定选用亚历山大硅酸盐培养基[16]，固氮菌筛选及活性测定用Ashby无氮培养基[17]，解磷菌筛选培养基参考赵小蓉等的方法配制[18]，CAS培养基按照荣良燕等的方法配制[19]，DF培养基和ADF培养基参考陈倩等的方法配制[20]。

1.1.3主要试剂及仪器

化学药品均为国产分析纯，Premix rTaq购自TaKaRa，细菌DNA提取试剂盒购自Omega，16S rRNA基因扩增引物由TaKaRa合成，主要仪器为THZ-82A气浴恒温振荡器(江苏普天，中国)、GelDoc XRS+凝胶成像仪(Bio-Rad，USA)、S1000快速梯度PCR仪(Bio-Rad，USA)、759紫外分光光度计(上海菁华，中国)等。

1.2方法

1.2.1菌株的分离与筛选

准确称取土壤10.0 g，加入带玻璃珠并装有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中振荡10 min后静置，取上清液1 mL依次通过10倍倍比稀释、分别获得终浓度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤悬液。利用涂布法将以上各浓度的土壤悬液分别涂布于解钾固体培养基、解磷固体培养基和Ashby无氮固体培养基上，挑出有透明圈的菌落及具不同菌落形态的菌落进行纯化并保存。将纯化的初筛菌株接种到相应的筛选培养基上培养后，分别测定水解圈(D)和菌落直径(d)。

1.2.2菌株的16S rRNA基因扩增及分子鉴定

采用细菌DNA抽提试剂盒提取菌株总DNA。以细菌总DNA为模板，利用原核生物16S rRNA基因通用引物27f(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492r(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增。25 μL反应体系包括DNA模板1 μL，PCR Premix rTaq 12.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增程序为：94℃ 5 min预变性；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，共30个循环；72℃延伸10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海英骏生物工程有限公司测序。所得的序列与NCBI数据库和EzTaxon数据库进行BLAST分析对比，选择同源性较高模式菌株的16S rRNA基因序列，采用MEGA6.0软件，用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树、置信度经Bootstrap法1000次重复检验。

1.2.3菌株促生特性的研究

1.2.3.1解钾活性的测定

将待测菌液按5%接种量接入50 mL解钾液体培养基中、以加入等量无菌水的解钾培养液为对照组，30℃ 100 rpm摇床振荡培养5 d，设置3个重复。培养液的处理采用过氧化氢灰化法，用原子吸收法测定对照组及处理组中的水溶性钾含量[21]。

1.2.3.2解磷活性的测定

将待测菌株的活化菌悬液1 mL接种入解磷液体培养基中，对照接入1mL无菌解磷培养液，置于28℃ 150 rpm摇床振荡培养7 d；培养液经10000 rpm离心10 min，取上清液用钼锑抗分光光度法测定水溶性磷含量[22]。

1.2.3.3固氮效能的测定

在含1%葡萄糖的Ashby无氮培养基中加入待测菌悬液(OD6001.0)1 mL，以加入1 mL无菌水的为对照，置于30℃ 150 rpm摇床振荡培养8 d后取出测氮定糖，设置3个重复；定糖采用蒽酮光电比色法，定氮采用柰氏比色法，固氮效能的测定参考成泽艳的方法[23]。

1.2.3.4产IAA能力的测定

以Salkowski法测定产吲哚乙酸的能力。将待测菌株接种于含有100 mg/L色氧酸(过滤除菌)的LB液体培养基中, 30℃ 180 rpm摇床培养1 d。取50 μL菌悬液滴于白色陶瓷板上，加入等量 Salkowski比色液；以加入50 mg/L吲哚乙酸的比色液作为阳性对照。白色陶瓷板于室温下避光放置30 min后观察，颜色变红者表明菌株可分泌IAA[24]。

1.2.3.5产NH3能力的测定

将菌株接到含10 mL蛋白胨水(10 g/L)试管中、28°C培养3 d后，每管加入0.5 mL Nessler's试剂，颜色由褐色转为黄色则表明有NH3产生[25]。

1.2.3.6产HCN能力的测定

在NB培养基中添加4.4 g/L甘氨酸，将细菌划线接种于该平板上，另将浸过2%碳酸钠、0.5% 2,4,6-三硝基苯酚的Whatman 1号滤纸置于培养基上，28°C培养4 d，滤纸颜色由橘黄色转为红色则表明有HCN产生[25]。

1.2.3.7产嗜铁素能力的定性测定

利用CAS法测定产嗜铁素能力。将CAS培养基划分成若干等分,接种待测菌株(10 μL 106CFU/mL)，28°C培养2 - 3 d，如菌株周边有黄绿色晕圈产生，即表明该菌株具产嗜铁素能力[19,26]。

1.2.3.8ACC脱氨酶活性的定性测定

将待测菌株接入5 mL无氮液体培养基中，30℃ 200 rpm 振荡培养1 d；吸取0.1 mL培养液接种至5 mL DF培养基振荡培养1 d；按2%接种量转接入5 mL ADF培养基中继续培养2 d。能以ACC为唯一氮源生长的菌株为 ACC 脱氨酶阳性菌株[17]。

1.3数据处理

试验数据处理采用Excel 2010 和SPSS 软件，多重比较采用LSD法。

2结果与分析

2.1菌株的分离筛选

4份茶园根际土样经选择性培养基筛选后，在Ashby无氮培养基上获得菌落形态明显不同的2个菌株KKS-6-N1和KKS-7-N7。在解钾培养基上获得12个菌株(表1)，水解圈直径/菌落直径之比值2.0的为菌株GD-3和GD-12。在解磷培养基上获得7个菌株(表2)，水解圈直径/菌落直径比值接近2.0的有KKS-6-P9和KKS-7-P10。将初筛获得的6个菌株分别置于其余两种选择培养基上，发现菌株GD-3及KKS-7-N7还可以在解磷培养基上生长，且D/d比值为2.86和4.57；菌株GD-12、KKS-6-P9和KKS-7-P10还可在无氮培养基上生长。因而，确定GD-3、GD-12、KKS-6-N1、KKS-7-N7、KKS-6-P9和KKS-7-P10共6个菌株进行促生特性的研究。

表1　茶树根际土壤解钾菌的初筛特性

表2　茶树根际土壤解磷菌的初筛特性

2.2菌株的分子鉴定

根据扩增的1.5 Kb片段长度的菌株16S rRNA基因核苷酸序列，与相近属种模式菌株的16S rRNA基因序列构建系统发育树(图1)，可初步鉴定KKS-6-N1为根瘤菌属(Rhizobiumsp.)，菌株KKS-7-N7及GD-3为假单胞菌属(Pseudomonassp.)，GD-12为芽孢杆菌属(Bacillussp.)，KKS-6-P9为束村氏属(Tsukamurellasp.)，KKS-7-P10为伯克霍尔德氏菌属(Burkholderiasp.)。

图1　茶树根际促生菌的16S rRNA基因系统发育树Fig. 1　Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences

2.3菌株促生特性的研究

2.3.1菌株的解钾解磷活性及固氮效能

待测的6株菌株中，仅有GD-3和GD-12具有解钾性能，接种GD-3与GD-12菌株的处理组中，水溶性钾含量分别为3.970.52 mg/L、3.900.10 mg/L，而对照组仅为1.270.22 mg/L， 处理组水溶性钾含量超过对照组的3倍以上。

除GD-12和KKS-6-N1菌株不能在解磷培养基上生长外，将其余4个菌株置于解磷液体培养基中培养，测定发酵液中的有效磷含量(表3)，结果表明，处理组的水溶性磷含量均显著高于对照组，且4个菌株之间并无显著差异。

以往研究多采用乙炔还原法测定固氮酶活性来间接反映固氮菌的固氮作用，但其受环境因子、反应容器体积及温育时间、采样方法、仪器及操作误差等因素的影响[27]。固氮效能是指固氮菌每消耗1 g糖从空气中固定氮素的毫克数[16]。本研究对6株待测固氮菌株进行了固氮效能测定(图2)，结果显示KKS-6-N1固氮效能最高，高达12.51±0.34毫克氮/克糖；其余4株菌固氮效能均接近或高于5毫克氮/克糖。

图2　6株茶树根际促生菌的固氮效能

菌株GD-3KKS-7-N7KKS-6-P9KKS-7-P10对照组有效磷含量(mg/L)99.67±13.15b97.47±4.21b79.67±5.99b84.88±12.84b17.89±9.15a

注：表中数据为平均数±标准误。小写拉丁字母表示显著水平α=0.05时多重比较(LSD法)结果。

2.3.2其他促生性能的定性测定

筛选获得的6个菌株进行了产IAA、产HCN、产NH3及分泌嗜铁素的能力，是否具有ACC脱氨酶活性等涉及促生机理的定性研究。结果表明，仅KKS-7-N7具有产IAA能力；GD-12、KKS-6-P9和KKS-6-N1具有产HCN能力，而菌株KKS-7-N7由于培养过程中产生绿色色素而无法准确判定。6株菌都具有产NH3的能力。除了GD-12外，GD-3、KKS-6-N1、KKS-7-N7、KKS-6-P9和KKS-7-P10等5个菌株具有分泌嗜铁素的能力。除了KKS-6-N1和KKS-7-N7菌株外，其余4个菌株均具有ACC脱氨酶活性。

3结论与讨论

本文从4份贵州地区茶园根际土壤中分离筛选到6个菌株，其中除菌株KKS-6-P9属于放线菌门(Actinobacteria)、束村氏菌科(Tsukamurellaceae)、束村氏菌属外，其余5个菌株均为细菌菌株，它们分属于假单胞菌属、芽孢杆菌属、伯克霍尔德氏菌属和根瘤菌属中，体现出根际促生菌的多样性。

孙建光等[17]报道，类芽孢杆菌和芽孢杆菌为小麦、水稻、玉米、白菜及芹菜等作物根际及土壤中的固氮菌优势种群，部分菌株具有ACC脱氨酶活性，少数菌株具有抗病潜能。除GD-3外，本文筛选到的5个菌株均具有一定的固氮能力，且大多有ACC脱氨酶活性和产NH3能力；固氮效能最高的是根瘤菌属KKS-6-N1菌株。已有研究表明，根瘤菌也可不形成根瘤而作为非豆科植物根际有益菌，促进植物生长[28]。

近年来，国内外学者分离的解钾菌呈现多样性，包括芽孢杆菌属[29]、固氮菌属(Azotobactersp.)、微杆菌属(Microbacteriumsp.)、中华根瘤菌属(Sinorhizobiumsp.)、根瘤菌属(Rhizobiumsp.)、慢生根瘤菌属(Mesorhizobiumsp.)、屈挠杆菌属(Flexibactersp.)和假单胞菌属等[30]。罗华元等人[31]筛选获得34株具有解钾能力的菌株，发酵液的水溶性钾含量在0.4-10.6 mg/L之间。本研究中，解钾菌GD-3与GD-12分属于假单胞菌属和芽孢杆菌属，培养液中的水溶性钾含量约4 mg/L，居于中等水平；2个菌株还具有ACC脱氨酶活性及其他促生潜能。

目前已报道的解磷菌包括细菌、真菌和放线菌，其中细菌最多，约20个属，真菌约5个属，放线菌中以链霉菌(Streptomycesspp.)居多[32-33]。本研究筛选到一株解磷菌株KKS-6-P9，属于放线菌门、束村氏菌属，该菌还具有产HCN、产NH3、产嗜铁素及具ACC脱氨酶活性，这是首次发现该属的菌株具有促生潜能。杨艳华等人[34]从茶树根际筛选获得23株解无机磷细菌，集中在Burkholderiasp.，Paenibacilluspolymyxa，Enterobactersp.和Bacillussp.，最大的解磷活性高达100 μg/mL。本文筛选的6株茶树根际细菌中，有4株具有解磷特性，它们分属于假单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属和束村氏菌属，这也与Bruto等[35]报道的大多数根际促生菌具解磷特性相符。

综上所述，本研究从茶树根际筛选到5株细菌菌株及1株放线菌，溶磷解钾性能最优的菌株为GD-3(Pseudomonassp.)，固氮性能最优的菌株是KKS-6-N1(Rhizobiumsp.)，具有解钾固氮性能的菌株为GD-12(Bacillussp.)，具有解磷固氮性能的菌株为KKS-6-P9(Tsukamurellasp.)、KKS-7-P10(Burkholderiasp.)和KKS-7-N7(Pseudomonassp.)；且多个菌株具有产NH3、产HCN、产IAA、产嗜铁素及ACC脱氨酶的能力。以上筛选菌株均有多种促生特性，应该具有一定的田间应用潜力，促生机理的进一步深入研究将为微生物菌肥的研制提供参考依据。

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Identification and Characterization of Plant Growth-promoting Rhizobacteria Isolated from Rhizosphere soils of Tea Trees

HANLi-zhen*,DENGZhao-hui,ZHUChun-yan,LIANGCai-jiao,WEIDe-ping

(CollegeofLifeSciences,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Abstract:Based on sequence conservation of 16S rRNA, six strains of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR), which isolated from rhizosphere soils of Guizhou tea trees, were identified as Pseudomonas sp., Bacillus sp., Tsukamurella sp., Burkholderia sp. and Rhizobium sp. GD-3 showed the most efficiency in phosphatesolubilization and potassium decomposition, and KKS-6-N1 had the most efficiency in nitrogen fixing. In addition, other growth-promoting characteristics, e.g. nitrogen fixation,IAA, NH3, HCNproduction,siderophore secretion and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase activity, were also investigated in these six strains, justifying their potentials for development ofbiological fertilizer as microbial resources in the future.

Keywords:Tea trees; Plant growth-promoting rhizobacteria; Growth-promoting characteristics

文章编号：1008-0457(2016)01-0051-06国际DOI编码：15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.01.011

中图分类号：Q938.1

文献标识码：A

*通讯作者：韩丽珍，女，博士，教授，硕士生导师，主要研究方向：环境微生物及微生物生态学；E-mail：hanlizhen11@163.com。

基金项目：贵州省大学生创新训练计划项目“贵州省茶树根际促生菌的促生机理研究”(201510657041)。

收稿日期：2016-1-30；修回日期：2015-2-2