趋化因子CXCL14在甲状腺乳头状癌中的表达水平及其临床意义

许静

（河北省唐山市工人医院内分泌二科，河北唐山063000）



趋化因子CXCL14在甲状腺乳头状癌中的表达水平及其临床意义

许静

（河北省唐山市工人医院内分泌二科，河北唐山063000）

摘要：目的探讨趋化因子CXCL14在甲状腺乳头状癌中的表达及其与临床病理的关系。方法采用免疫组织化学方法、蛋白印迹法（Western blot）检测120例甲状腺乳头状癌、40例结节性甲状腺肿及40例正常甲状腺组织中CXCL14的表达水平，并分析其与甲状腺乳头状癌的临床病理特征的关系。结果免疫组织化学结果表明，甲状腺乳头状癌组织中CXCL14蛋白阳性率（20.83%）较结节性甲状腺肿（85.00%）、正常甲状腺组织（75.00%）明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。Western blot结果表明，CXCL14蛋白在甲状腺乳头状癌组织中的表达量为（0.823±0.143），明显低于结节性甲状腺肿组织（1.211±0.012）和正常甲状腺组织（1.219± 0.004），差异有统计学意义（P<0.05）。CXCL14蛋白的表达与甲状腺乳头状癌的包膜浸润、淋巴结转移、肿瘤临床分期及肿瘤分化有关（P<0.05）。CXCL14高表达组的甲状腺乳头状癌患者的生存率明显高于CXCL14低表达组（P<0.05）。结论CXCL14蛋白的表达可能成为判断甲状腺乳头状癌恶化程度及预后的指标。

关键词：甲状腺乳头状癌；趋化因子CXCL14；免疫组织化学法；蛋白印迹法

甲状腺癌是内分泌肿瘤中最常见的，而甲状腺乳头状癌又占甲状腺癌的80%以上[1]，因此尽早对甲状腺乳头状癌患者进行诊治具有重要意义。肿瘤细胞的生长受到许多因素的影响，趋化因子与肿瘤的发生、发展、浸润及转移密切相关。[chemokine （C-X-C motif）ligand 14，CXCL14]是CXC趋化因子家族成员之一，在多种组织和细胞中均有表达。近期研究显示，CXCL14在肾癌[2]、结直肠癌[3]、肺癌[4]、宫颈癌[5]、乳腺癌[6]中都呈低表达，而在部分骨肉瘤[7]、前列腺癌[8]、胰腺癌[9]中却高表达，在甲状腺乳头状癌中的作用报道较少。本研究应用免疫组织化学方法和蛋白印迹法（Western blot）检测CXCL14在甲状腺乳头状癌中的表达情况，统计学分析其与甲状腺乳头状癌患者临床病理特征及预后的相关性，为甲状腺乳头状癌的临床诊断及治疗提供理论依据。

1　资料与方法

1.1主要实验材料

选取2003年2月-2004年10月于唐山市工人医院行甲状腺切除的甲状腺乳头状癌组织120例，结节性甲状腺肿40例，正常甲状腺组织40例。甲状腺乳头状癌患者中，女性68例，男性52例；<45岁56例，≥45岁64例；有包膜浸润的65例，无包膜浸润的55例；有转移者70例，无转移者50例；分化程度：低分化64例，高、中分化36例；按照2002年UICC（国际抗癌联盟）的TNM进行分期：Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期55例。所有标本的收集均征得患者及家属的同意，部分组织置于液氮中保存，用于Western blot检测，部分组织置于10%甲醛溶液中固定，用于免疫组织化学法检测。全部标本均行常规HE染色，明确病理诊断，病历资料具有可比性。所有患者术前均无放疗或者化疗史。

1.2主要实验试剂

免疫组织化学及Western blot试剂，兔抗人CXCL14多克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3实验方法及步骤

1.3.1免疫组织化学组织标本经常规脱水，石蜡包埋，4μm厚连续切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水处理后，进行0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液及微波抗原修复。室温下湿盒中封闭20 min，滴加CXCL14兔抗人多克隆抗体（1∶100），置湿盒中4℃冰箱中过夜。第2天滴加二抗，然后置湿盒内孵育10 min，孵育完毕后进行二氨基联苯胺（DAB）显色，再进行苏木精复染，常规脱水，最后进行封片。结果判定：以染色强度和阳性细胞百分率相乘得出的饱和指数（saturation index，SI）进行评估。染色强度：无阳性染色（0分），弱染（1分），中染（2分）,强染（3分）。染色区域如下：肿瘤细胞<25%（1分），25%～50%（2分），51%～75%（3分），>75%（4分）。该因子的表达水平由SI指数决定，SI指数≥4为肿瘤因子阳性表达，SI指数≤3为肿瘤因子阴性表达。以磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗作阴性对照组。

1.3.2Western blot方法取新鲜标本约100 mg，用考马斯亮蓝试剂盒定量。取50μg蛋白上样到配置好的SDS-PAGE凝胶，电泳，将凝胶上的蛋白电转移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），用5%脱脂奶粉封闭1 h，加一抗CXCL14兔抗人多克隆抗体（1∶100），室温孵育2 h后4℃过夜，0.1% TBST液洗PVDF膜3×5 min，加入对应二抗,室温孵育1 h洗膜3×5 min，洗膜后加入ECL发光液，曝光，显影，定影，对X光底片拍照保存。

1.4统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，计数资料3组间的比较先用χ2检验，在χ2检验有意义的基础上再行χ2分割法进行两两比较；多组计量资料的比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验的方法；生存分析用Kaplan-Meier法，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1CXCL14在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿及正常甲状腺组织中的表达情况

免疫组织化学结果显示，CXCL14阳性表达的甲状腺组织呈浅黄色、棕黄色或黄褐色（见图1）。甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿及正常甲状腺组织中CXCL14的阳性表达率分别为20.83%（25/120）、85.00%（34/40）和75.00%（30/40），3组CXCL14阳性率的差异有统计学意义（χ2=56.803，P <0.05）。（见表1）。甲状腺乳头状癌组CXCL14的阳性率明显低于结节性甲状腺肿组和正常甲状腺组，差异有统计学意义（χ2=53.065和39.019，P<0.01）；结节性甲状腺肿组与正常甲状腺组CXCL14的阳性率比较，差异无统计学意义（χ2=1.250，P >0.01）（见表1）。Western blot结果显示（见图2），CXCL14蛋白在甲状腺乳头状癌组织中的表达量为（0.823±0.143），明显低于结节性甲状腺肿组织（1.211±0.012）和正常甲状腺组织（1.219±0.004），差异有统计学意义（P< 0.05），而其在结节性甲状腺肿组与正常甲状腺组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

图1　免疫组织化学检测CXCL14在甲状腺组织中的表达（×200）

2.2CXCL14在甲状腺乳头状癌的表达与临床病理参数的关系

包膜浸润中两组CXCL14阳性率的差异有统计学意义（χ2=8.709，P<0.01），无包膜浸润组CXCL14的阳性率明显高于有包膜浸润组；淋巴转移中两组CXCL14阳性率的差异有统计学意义（χ2=15.315，P<0.01），无淋巴结转移组的CXCL14阳性率明显高于淋巴结转移组；临床分期中两组CXCL14阳性率的差异有统计学意义（χ2=6.064，P<0.05），Ⅰ、Ⅱ期临床分期组CXCL14的阳性率明显高于Ⅲ、Ⅳ期临床分期组；分化程度中两组CXCL14阳性率的差异有统计学意义（χ2=5.774，P<0.05），高、中分化组CXCL14的阳性率明显高于低分化组。CXCL14的阳性率与患者的性别、年龄和发生部位无关，组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表1　CXCL14在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿及正常甲状腺组织中的表达情况

图2　Western blot检测CXCL14蛋白的表达

2.3CXCL14在甲状腺乳头状癌的表达与患者预后的相关分析

对120例随访资料齐全的病例进行生存分析，所有病例随访截止于2014年5月，随访时间120个月，绘制生存曲线（见图3）。CXCL14低表达组共95例，其中36例存活、59例死亡，其生存率为37.89%；CXCL14高表达组共25例，其中20例存活、5例死亡，其生存率为80%。CXCL14高表达组病例的生存率明显高于CXCL14低表达组（P<0.05）。

表2　CXCL14在甲状腺乳头状癌组织中的表达与临床病理特征的关系

图3　不同CXCL14表达的甲状腺乳头状癌患者的生存曲线

3　讨论

近年来，甲状腺癌患病率呈逐渐上升的趋势[10]，其发病机制非常复杂。越来越多的趋化因子及其受体被证实与肿瘤的发生、发展有关，随着研究的不断深入，有些趋化因子已经成为抗癌的治疗靶点。而CXCL14作为CXC趋化因子家族成员之一，其在甲状腺乳头状癌中的作用目前仍未明确。CXCL14最初是由Hromas等[11]于1999年从人类乳腺和肾脏组织中分离出来的，属于肿瘤抑制基因。已有研究证实，它可以趋化单核细胞、B细胞、树突状细胞和NK细胞[12]。CXCL14参与调控体内许多生物学功能，如肿瘤相关血管的形成、炎症免疫反应、宿主对肿瘤特异性免疫的激活以及肿瘤的自分泌调节等[13]。作为一个多功能趋化因子的CXCL14与多种肿瘤的发生发展都密切相关。研究显示，CXCL14在肾癌、结直肠癌、肺癌、宫颈癌组织中的表达减少或者缺失[2-5]。Gu等[6]还发现，乳腺癌中CXCL14蛋白的表达与淋巴结转移具有负相关性。因此，CXCL14在肿瘤增殖、转移等方面起着重要作用。本实验研究CXCL14在甲状腺乳头状癌中的表达情况，有助于进一步全面明确甲状腺乳头状癌的恶性生物学行为及机制，为甲状腺乳头状癌患者的早期诊断、合理治疗以及预后判断找到新的靶点。

本研究运用免疫组织化学及Western blot技术检测CXCL14蛋白在甲状腺乳头状癌组织、正常甲状腺组织及结节性甲状腺肿中的表达量，结果显示，该蛋白在甲状腺乳头状癌中的表达水平低于正常甲状腺组织和结节性甲状腺肿。这表明CXCL14蛋白可能在防止甲状腺乳头状癌的发生中起到作用。已有研究证实，CXCL14可以通过抑制微血管系统和血管平滑肌细胞的趋化来抑制肿瘤血管的形成，从而抑制肿瘤细胞的成瘤和转移[14]。

笔者还进一步对CXCL14蛋白的表达与甲状腺乳头状癌各临床病理指标的关系进行分析，结果显示，CXCL14蛋白的阳性表达与甲状腺乳头状癌的包膜浸润、淋巴结转移、肿瘤临床分期及肿瘤分化有关。在无包膜浸润、无淋巴结转移、临床分期早和分化程度高的甲状腺乳头状癌组织中CXCL14表达相对增加。结果显示，CXCL14与甲状腺乳头状癌的进展密切相关，与甲状腺乳头状癌的恶性程度呈负相关，可以抑制肿瘤的增殖、浸润以及转移。已有研究发现，在CXCL14阴性表达的人头颈部鳞状细胞癌系PCI-16中导入CXCL14基因会导致树突状细胞向肿瘤内部浸润的能力增强，抗肿瘤的免疫反应也随之增强[15]。因此，可以认为，CXCL14可能是通过启动肿瘤免疫反应来抑制肿瘤的转移和浸润。生存分析结果显示，CXCL14低表达组的甲状腺乳头状癌患者的生存率明显低于CXCL14高表达组，表明CXCL14低表达与甲状腺乳头状癌患者的预后差有关。

综上所述，本研究结果提示，CXCL14可能是预测甲状腺乳头状癌恶性生物学行为的新标志，同时其基因也是抗肿瘤靶向治疗的一个新的突破点。检测肿瘤组织中CXCL14的表达水平对患者的早期诊断、合理治疗以及预后判断有一定的帮助。

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（张蕾编辑）

论著

Expression and significance of CXCL14 protein in papillary thyroid carcinoma

Jing Xu
(Department of Endocrinology, the Workers Hospital of Tangshan, Tangshan, Hebei 063000, China)

Abstract:Objective To analyze the expression of chemokine CXCL14 in papillary thyroid carcinoma and its correlation with clinicopathologic parameters. Methods Immunohistochemistry and Western blot were used to assess the expression of CXCL14 protein in 120 cases of papillary thyroid carcinoma, 40 cases of nodular goiter and 40 cases of normal tissues, and its association with clinicopathologic parameters was analyzed. Results Immunohistochemistry showed that the expression of CXCL14 was positive in 20.83% of papillary thyroid carcinoma tissue, which was significantly higher than that in nodular goiter (85.00%) and nomal tissue (75.00%) (P < 0.05 ). Western blot showed that the relative amount of CXCL14 protein in papillary thyroid carcinoma tissue was (0.823±0.143) significantly higher than in nodular goiter (1.211±0.012) and normal tissues (1.219±0.004) (P < 0.05). The expression of CXCL14 was correlated with envelope invasion, lymph node metastasis, clinical stage and differentiation (P< 0.05). The survival rate of patients with thyroid papillary carcinoma in high expression of CXCL14 was significantly higher than the low expression of CXCL14 (P < 0.05 ). Conclusions The expression of CXCL14 may be a marker for adjudging the malignancy and prognosis of papillary thyroid carcinoma.

Keywords:papillary thyroid carcinoma; CXCL14; immunohistochemistry; Western blot

收稿日期：2015-11-25

文章编号：1005-8982（2016）08-0060-05

DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2016.08.013

中图分类号：R736.1

文献标识码：A