亚油酸对食品加工中晚期糖基化终产物的影响

刘玲，岳璐，赵鑫，康世墨

(沈阳农业大学 食品学院，辽宁 沈阳，110866)



亚油酸对食品加工中晚期糖基化终产物的影响

刘玲*，岳璐，赵鑫，康世墨

(沈阳农业大学 食品学院，辽宁 沈阳，110866)

摘要研究一种不饱和脂肪酸——亚油酸对糖基化反应体系主要中间产物及终产物的作用，探讨在食品加工中不饱和亚油酸对晚期糖基化产物的影响。建立亚油酸、D-葡萄糖和L-赖氨酸反应的微乳体系，采用紫外-可见吸光光度法检测中间产物乙二醛、丙二醛和果糖胺的生成量；荧光法检测戊糖素和荧光性晚期糖基化终产物(advanced glycation end-products，AGEs)的生成量；高效液相色谱法检测终产物羧甲基赖氨酸[Nε-(carboxymethyl)lysine，CML]的生成量，分别比较各生成产物的变化，探讨亚油酸对反应途径的影响。结果显示：从中间产物上看，亚油酸能有效参与羰胺的糖基化反应，提高中间产物乙二醛含量，增加丙二醛含量，减少果糖胺的生成；从终产物来看，亚油酸的存在对戊糖素的生成量影响不明显，但能明显抑制羧甲基赖氨酸的形成并抑制荧光性AGEs的累积。在糖基化反应体系中亚油酸的存在一方面能够氧化葡萄糖，使参与羰胺反应的葡萄糖减少；另一方面因氧化促进了乙二醛等活性醛的生成，从而加速乙二醛与赖氨酸之间的反应，减少了参与羰胺反应的赖氨酸含量；亚油酸参与反应使中间产物丙二醛含量增加，进而增加了羧甲基赖氨酸同源的羧乙基赖氨酸(CEL)的生成量，减少了非荧光性产物羧甲基赖氨酸和荧光性AGEs生成量。

关键词亚油酸；晚期糖基化终产物；羰胺反应；糖基化反应

美拉德反应(Maillard reaction)是食品加热或贮藏过程中，还原糖的羰基和蛋白质或多肽中氨基及游离氨基酸经缩合和聚合反应生成类黑色素的反应，又称“羰胺反应”。其中，晚期糖基化终产物(advanced glycation end-products，AGEs)是其生成的一类稳定、不可逆的化合物[1-3]，可通过人体膳食进入体内。大量研究表明，AGEs可引起蛋白质分子交联，使蛋白质结构、功能、溶解性等性质发生改变。当人体内AGEs累积时，可引起粥样动脉硬化、心血管疾病、糖尿病、尿毒症、阿尔茨海默症等[4-9]。现代研究发现，食品具有较多的营养成分在加工中易形成AGEs，特别是在高脂和高蛋白食品中[10]。

AGEs不是单一产物，包括20多种。其中一些是有荧光性的交联产物，一些是非荧光性物质。其中，羧甲基赖氨酸[Nε-(carboxymethyl)lysine，CML]是糖基化反应中的重要产物，是AGEs最主要的成分之一[11]，无荧光性，常被看作是检测食品中AGEs含量的主要目标产物[12]。戊糖素是一种具有荧光的蛋白交联物质，主要是戊糖和L-赖氨酸、精氨酸通Amadori重排继后脱水和氧化断裂而产生，在葡萄糖和氨基酸的反应中也少量产生[13]。果糖胺作为美拉德糖基化反应的早期产物，是衡量美拉德反应的主要指标[14]。乙二醛(glyoxal，GO)是糖基化反应的前期重要产物，其糖化性能比葡萄糖高约20 000倍，是生成AGEs的重要前体物质[15]。丙二醛(methylglyoxal，MGO)是乙二醛的同系物，与乙二醛很类似可通过糖基化反应经阿玛多利重排生成[16]。

目前关于食品中AGEs的研究多限于对CML生成路径或含量，其中，韩立鹏研究了含脂食品中羧甲基赖氨酸的生成路径[17]；卞伟华等分析了国内常见食品中CML的含量[18]，但关于含脂类食品中AGEs形成机理的深入研究鲜有报道。本文以C18∶2不饱和脂肪酸(亚油酸)为代表，,检测并分析不同反应时间4种中间产物GO、MGO、果糖胺、戊糖素的含量以及主要终产物CML和AGEs的含量以其变化，探究亚油酸在食品加工中对晚期糖基化终产物生成的主要影响。

1材料与方法

1.1主要材料与试剂

L-赖氨酸，上海国药集团化学试剂有限公司；D-葡萄糖，上海国药集团化学试剂有限公司；Span 80，Genview公司；Tween 20，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；亚油酸，上海瑞永生物科技有限公司；正丁醇，天津市富宇精细化工有限公司。

1.2仪器与设备

磁力搅拌器(ZNCL-B)，北京神泰伟业仪器设备有限公司；紫外分光光度计(722)，北京普析通用仪器有限责任公司；荧光分光光度仪(F-4600)，日立公司；高效液相色谱仪(Prominence LC-20AB)，岛津公司。

1.3实验方法

1.3.1L-赖氨酸和D-葡萄糖含脂美拉德微乳体系的制备

取适当比例Span 80、Tween 20与少量正丁醇，磁力搅拌器搅拌均匀。加入1.0 g亚油酸并将0.2 mol/L的L-赖氨酸与0.6 mol/L的D-葡萄糖以1∶3的质量比加入，将上述体系溶解在pH 8.0的磷酸缓冲液(PBS)中，作为含脂美拉德反应体系(简称含脂体系)。以L-赖氨酸与D-葡萄糖反应的美拉德体系(简称非脂体系)为对照，在温度为60 ℃水浴锅中分别反应0～40 h。平行反应重复3次。

1.3.2早期糖基化产物GO的测定

分别取0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40 h各组反应样液0.5 mL于50 mL容量瓶中，加入1 500.0 mg/L乙酸钠溶液1.0 mL、2 000.0 mg/L盐酸羟胺溶液2.0 mL。50 ℃水浴加热20 min，冷却后用蒸馏水定容，测定233 nm处紫外吸光值。平行反应重复3次。

1.3.3早期糖基化产物MGO的测定

分别取反应液1.0 mL加入质量分数(下同)0.5%硫代巴比妥酸溶液5.0 mL，摇匀，放入水浴中煮沸10 min后取出冷却。再使用离心机3 000 r/min分离提取液15 min，取上层清液。以0.5%硫代巴比妥酸溶液为空白，测定450、534和600 nm处吸光值。

C(MGO) = 6.45(D532-D600) -0.56D450

1.3.4早期糖基化产物果糖胺的测定

硝基四氮唑蓝(NBT)还原法。分别取0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40 h各组反应样液40.0 μL，加0.025 mol/L NBT试液2.0 mL。35 ℃反应5 min，以10%醋酸溶液中止反应，测定530 nm处的紫外吸光值。平行反应重复3次。

1.3.5戊糖素的测定

分别取0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40 h各组反应样液0.1 mL于小试管中，用PBS缓冲液稀释30倍，在激发波长335 nm，发射波长385 nm处测定荧光值。平行反应重复3次。

1.3.6糖基化产物 CML 的测定

采用HPLC检测糖基化反应体系中CML的生成量。分别取反应0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40 h的各组反应样液，经0.45 μm滤膜过滤，取10 μL加入高效液相色谱仪，非脂体系为对照组。平行反应重复3次。

高效液相色谱法条件：色谱柱：WatersAtlantisT3 C18色谱柱(150 mm Atlant 5 μm)；流动相：V(体积分数0.1%甲酸)∶V(甲醇)=70∶30；流动相流速 0.5 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：10 μL；运行时间：10 min。

1.3.7荧光性 AGEs 的测定

分别取0、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40 h各组反应样液0.1 mL于小试管中，非脂体系为对照组，用PBS缓冲液稀释30倍，在激发波长370 nm,发射波长440 nm处测定荧光值。

1.3.8数据处理方法

采用SPSS 13.0软件数据分析；采用Origin 8.0软件作图。

2结果与分析

2.1两体系中GO生成量的变化

由图1可知，在相同的反应时间内两体系GO的含量均成上升趋势，但含脂体系中GO的含量明显高于非脂体系(P<0.01)。说明亚油酸可能参与到糖基化反应中，经羰胺反应生成GO；或亚油酸自身氧化而产生羰基化合物，进而生成GO[19]。

图1　乙二醛生成量随反应时间的变化Fig.1　Production of theglyoxal with reaction time

2.2两体系MGO生成量的变化

由图2可见，两体系MGO生成量的变化趋势基本一致。0～10 h MGO生成量逐渐减少，10～40 h MGO含量持续增加，在反应过程中含脂体系MGO的含量始终高于非脂体系的含量。这说明亚油酸糖基化反应生成GO的同时还生成了MGO。MGO是羧乙基赖氨酸(CEL)的重要前体物质，其含量的升高意味着CEL的累积[20]。

图2　丙二醛生成量随反应时间的变化Fig.2　Production of the methylglyoxal with reaction time

2.3两体系果糖胺生成量的变化

由图3可见，2种反应体系中果糖胺的生成变化趋势相同，即含量先随反应时间延长而增加，15 h后逐渐下降，后期迅速上升。这说明在果糖生成一定时间后，因逐步参与美拉德中末期反应而消耗，吸光值呈下降趋势；20 h后可能随终末期反应产物的累积，后期反应速度减慢，果糖胺逐渐累积，吸光值回升。

图3　果糖胺生成量随反应时间的变化Fig.3　Production of the fructosamine with reaction time

在反应的整个过程中，含脂体系中的果糖胺生成量显著(P<0.01)低于非含脂体系，这是因为亚油酸的参与导致反应途径的变化。一方面是亚油酸和D-葡萄糖竞争性地与L-赖氨酸发生反应，使赖氨酸与D-葡萄糖之间的美拉德反应产物减少，果糖胺生成量减少；另一方面，由于油脂本身逐步氧化，造成D-葡萄糖随之氧化，从而生成活性醛类产物[21]，不再经美拉德反应途径生成果糖胺，这样也造成了果糖胺生成量的减少。

2.4两体系戊糖素生成的变化

戊糖素主要是戊糖和赖氨酸、精氨酸生成的，葡萄糖在有氧条件下可以少量的生成。戊糖素含量可视为评估糖基化过程中蛋白质损伤的重要参数[22]。从图4可见，随反应时间的增加，两体系中戊糖素的含量均呈现先增加后减少的趋势，说明在加工中戊糖素的生成量存在最大值点，但含量不高。两体系中产生的戊糖素含量差别不大，这说明亚油酸的参与对戊糖素的生成影响不大。

图4　戊糖素生成量随反应时间的变化Fig.4　Production of the pentosidine with reaction time

2.5两体系CML生成量的变化

0～40 h反应体系中主要产物CML含量的变化见图5，以CML含量测定的吸收峰表征。从图5中可以看出，0～10 h内含脂体系CML的生成量略低于非含脂体系的含量，但两体系含量都保持着缓慢上升的趋势。从10 h开始，含脂体系与非含脂体系CML的含量差异逐渐明显，但都以较快的速度增长。反应至32 h非脂体系比含脂体系CML含量多50%，40 h反应至末期时，2种体系内CML的含量逐渐接近。

图5　CML生成量随反应时间的变化Fig.5　Production of the CML with reaction time

CML含量在两体系中变化的原因考虑主要有2个方面。一方面，亚油酸参与糖基化反应的同时也在进行自身氧化，其氧化产物乙二醛等二羰基化合物与L-赖氨酸生成乙二醛-L-赖氨酸二聚体和其他二聚体，使参与生成CML的L-赖氨酸量减少，导致含脂体系CML的含量比非脂体系少；另一方面，从图2可见，含脂体系产生MGO的含量高于非脂体系。MGO可进一步通过阿玛多利重排生成CML的类似物CEL[23-24]，因此含脂体系生成的CEL多于非脂体系，而CML含量低于非脂体系。

2.6两体系荧光性AGEs生成量的变化

由图6可知，反应0～8 h期间，含脂体系中AGEs的生成量高于非脂体系，并处于迅速上升阶段；8～40 h后非脂体系中AGEs的生成量缓速升高，非脂体系AGEs含量明显高于含脂体系。

图6　荧光性AGEs生成量随反应时间的变化Fig.6　Production of the fluorescence AGEs with reaction time

与含脂体系中CML的含量低于非含脂体系原因类似，由于亚油酸除了参与美拉德反应直接生成AGEs之外，还能够生成一些活性的羰基化合物，这些羰基化合物能够与L-赖氨酸反应进一步反应生成AGE，也能经聚合反应生成乙二醛-L-赖氨酸二聚体，丙二醛-L-赖氨酸二聚体等无荧光物质[25]，这些聚合物在反应中期的逐渐生成消耗了L-赖氨酸，使得含脂体系中参与羰胺反应的赖氨酸减少，故羰胺反应进行缓慢[26]，羰胺化合物产生量较少，导致含脂体系比非含脂体系后期生成AGEs的含量减少。

3结论

通过建立亚油酸、D-葡萄糖和L-赖氨酸的含脂微乳模拟体系，分析早、中期产物果糖胺和乙二醛、丙二醛和主要产物戊糖素、非荧光性产物CML和荧光性AGEs含量的变化，探讨亚油酸对糖基化反应的影响。经含脂和非脂体系的对比发现，亚油酸促进乙二醛和丙二醛合成量，减少果糖胺的生成，对戊糖素的生成量影响不明显，对CML的生成具有抑制作用，减少荧光性AGEs生成。结果表明，油脂的存在一方面氧化赖氨酸，使参与羰胺反应的赖氨酸减少，进而减少了非荧光性产物CML和荧光性AGEs生成。另一方面亚油酸的氧化增加了乙二醛等活性醛的生成，促进了乙二醛与赖氨酸之间的反应，减少了参与羰胺反应的赖氨酸；同时亚油酸使丙二醛的生成量增加，进而增加CEL生成量，导致CML的含量和AGEs含量减少。

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Effects of linoleic acid on intermediate and final product in glycosylation in food processing

LIU Ling*, YUE Lu, ZHAO Xin, KANG Shi-mo

(Food College of Shenyang Agricultural Uinversity，Shenyang 110866， China)

ABSTRACTThe effect of an unsaturated fatty acid-linoleic acid on main intermediate products and final products in glycosylation reaction was studied. A microemulsion system of linoleic acid, D-glucose and L-lysine was established. Intermediate products including glyoxal, malondialdehyde and fructosamine were detected by UV spectrophotometry. The pentose and fluorescence AGEs were determined by the fluorescence spectrophotometry. One of the end product, carboxymethyl lysine (CML) was detected by high performance liquid chromatography (HPLC). Then these products were compared and the effect of linoleic acid on the reaction pathway was further elucidated. Linoleic acid can effectively participate in the glycosylation reaction in the intermediate products; it increased the content of glyoxal and malondialdehyde, and reduced generating of fructosamine. In the final products, the effect of linoleic acid to pentosidine formation is not obvious, but linoleic acid significantly inhibited CML formation and inhibited fluorescent AGEs accumulation. Linoleic acid oxidized glucose, which decreased content in carbonyl amine reaction; On the other hand, oxidation promoted the formation of glyoxal and some other reactive aldehydes, thus accelerated the reaction between glyoxal and lysine. Furthermore, the lysine content was decreased in carbonyl amine reaction; malondialdehyde content was increased after adding linoleic acid into reaction, CEL content was increased, and the content of CML and fluorescence AGEs were reduced.

Key wordslinoleic acid; advanced glycation end products; carbonyl amine reaction; glycosylation

收稿日期：2015-07-17，改回日期：2015-10-21

基金项目：辽宁省自然科学基金项目(No.2014027003)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604015

第一作者：博士，副教授(本文通讯作者，E-mail:1210197616@qq.com)。