液相小体积提取GC-MS检测尿液中百草枯还原产物

周晓英，　孙　琴，　李普济，　代　勇

(1.四川警察学院刑事科学技术系， 四川泸州　646000；2.四川医科大学药学院， 四川泸州　646000；3.四川省公安厅刑侦局， 四川成都　610043)



液相小体积提取GC-MS检测尿液中百草枯还原产物

周晓英1，孙琴2，李普济3，代勇1

(1.四川警察学院刑事科学技术系， 四川泸州646000；2.四川医科大学药学院， 四川泸州646000；3.四川省公安厅刑侦局， 四川成都610043)

摘要目的 建立尿液中百草枯液相小体积提取- 气相色谱- 质谱联用的含量测定方法。方法 在加入定量百草枯标准品的尿液试样中，用磷酸缓冲液调pH=8，以乙基百草枯为内标，以硼氢化钠为还原剂，在60 ℃环境下反应10 min后，加入0.2 mL乙醚，超声振荡3 min，离心后直接取上清液进样，GC-MS(SIM)检测。结果 尿液中百草枯标准曲线线性范围在0.1 μg/mL～50 μg/mL，最小检测限可达0.05 μg/mL，平均回收率均在90%～110%之间。相对标准偏差均在12%以内。结论 本方法简便、快捷、准确，能用于生物检材中百草枯的检测。

关键词百草枯； 液相小体积提取； 气质联用； 尿液

0引言

作为一种广谱性、接触性和灭生性除草剂，百草枯(1-1-二甲基-4-4联吡啶阳离子盐)自上世纪七八十年代进入我国后，很快在农业中被推广应用，但随之而来的是百草枯中毒事件呈逐年上升趋势。大多数中毒案件(包括自杀、他杀和事故等)都源自于口服百草枯水溶液而造成的中毒与死亡。当其口服后，会对口腔、咽喉、食管等消化系统造成腐蚀性损害，严重时导致腹部与胸部疼痛、血便、呼吸困难、肺纤维化、昏迷等症状并直至死亡，同时还会诱导多种器官(肝、肾、心脏等)产生毒发性病变[1-2]。

目前，鉴于百草枯的不挥发性和在碱性环境中不稳定等特点，对生物检材(主要为血液与各脏器)中百草枯的检测大多以反相离子对(离子对试剂多为各种烷基的磺酸盐)HPLC进行检测[3-4]，同时，也有报道将百草枯经硼氢化钠还原成挥发性成分后进行GC-MS检测[5-6]，此外还有毛细管电泳法、分光光度法及免疫化学分析法等检测手段。在样本的前处理方式上，鉴于常规液-液萃取杂质较多，回收率低，较易产生乳化现象等，大多采用固相萃取进行生物样本的前处理。而近年来出现的液相微萃取技术及其衍生出的液相小体积提取技术，集采样、萃取、浓缩于一体，已逐渐开始应用于生物样本的前处理上，并取得了良好的效果[7-8]。

本文以尿液中的百草枯为检测对象，以液相小体积提取作为样品前处理方式，通过对提取条件的考察，确定了GC-MS(SIM)检测尿液中百草枯经硼氢化钠还原后产物的方法(百草枯及其内标物乙基百草枯的还原反应方程式如图1所示)，为公安机关对百草枯中毒案件中生物样本的检测提供了可供参考与借鉴的方法。

图1　　　　百草枯还原反应方程式(左)和乙基百草枯　　　还原反应方程式(右)

1实验部分

1.1仪器及测试条件

Agilent- 6890 series气相色谱仪，配G1530A质谱仪；色谱柱为键合HP- 5MS柱(30.0 m×0.25 mm ×0.1 μm)，以氦气作为载气，流速为0.8 mL/min，不分流，进样口与质谱检测器温度均为270 ℃，EI源，电离能70 eV；程序升温：起始温度80 ℃，保持1 min，然后以10 ℃/min升温至200 ℃，再以20 ℃/min升温至270 ℃，保持4 min；SIM测试中，选择的定性监测离子为百草枯(m/z134、m/z148、m/z192，其中m/z192作为定量离子)，乙基百草枯(m/z148、m/z162、m/z220，其中m/z162作为定量离子)。

1.2药品与试剂

标准品百草枯、乙基百草枯(内标物)均购自百灵威科技有限公司。乙醚(经重蒸过)、氯化钠、磷酸二氢钾、硼氢化钠等其余试剂均为分析纯。

标准储备液的制备：分别精密称取适量百草枯、乙基百草枯标准品，配置成浓度为1 mg/mL的百草枯标准品溶液和0.1 mg/mL乙基百草枯标准品溶液，置于水箱内，-4 ℃保存备用。

1.3试验方法

1.3.1尿液样品的制备

取空白尿液5 mL，精确适量添加百草枯标准储备液，配制成百草枯含量为50 μg/mL的尿液样品。

1.3.2试验步骤

取添加百草枯的尿液样品0.5 mL，加入1.5 mL磷酸缓冲液(pH=8)和20 μL浓度为0.1 mg/mL的乙基百草枯标准品溶液，同时再加入10 mg固体NaBH4，在60 ℃反应10 min后冷却至常温，加入0.2 mL乙醚，超声振荡3 min，离心1 min后直接取上清液1 μL进样，GC-MS(SIM)检测。

2结果与讨论

2.1色谱柱的选择

百草枯在硼氢化钠还原剂的作用下，其吡啶环被还原，但其胺基基团依然存在，因此其极性虽略有改变，但仍属中等极性，故我们选择了极性较强的HP-5键合毛细管柱作为分析柱，取得了良好的分离效果，其总离子流色谱图(TIC)和还原产物质谱图如图2、图3所示。

1—百草枯还原产物；2—乙基百草枯还原产物(内标)图2　液相小体积提取添加百草枯标准品溶液(含内标)的TIC图

图3　百草枯还原产物(左)和乙基百草枯还原产物(右)的质谱图

2.2不同提取方法提取效果比较

目前百草枯生物样本的前处理通常采用固相萃取的方式进行，故本实验同时考察了固相萃取的提取效果，其步骤如下：

取添加百草枯的尿液样品0.5 mL，加入1.5 mL磷酸缓冲液(pH=8)和20 μL浓度为0.1 mg/mL的乙基百草枯标准品溶液，同时再加入10 mg固体NaBH4，在60 ℃反应10 min后离心，取上清液加入已经活化的C18固相萃取柱(经2 mL甲醇和2 mL缓冲液活化)，先用2 mL去离子清洗，再用2 mL甲醇进行洗脱，氮气流下挥干，残余物加0.1 mL甲醇溶解，取1 μL进样。

通过对比两种提取方式的萃取结果发现，固相萃取杂质去除效果好，提取效率也较高，但步骤较多，过程较为繁琐，不利于中毒案件的常规检测，而液相小体积提取作为一种动态小体积提取法；由于有机提取剂量远少于常规液- 液萃取，在提取中有机相表面积相对于提取体积本身比例增大，从而在提取过程中产生较为明显的富集作用，同时，在提取中的超声振荡使溶质和溶液间充分接触，有效地避免了乳化现象的产生和杂质干扰，提高了提取效率。

2.3提取条件考察

2.3.1萃取溶剂考察

比较了环己烷、乙醚、氯仿和二氧六环4种不同极性萃取剂对待测物的萃取效果。在添加待测物标准品的空白尿液中，调至pH=8后经硼氢化钠还原，再用以上4种有机溶剂提取，GC-MS检测。因待测物为中等极性物质，而环已环和二氧六环分别为弱极性与强极性，其提取效果低于中等极性的乙醚和氯仿，因氯仿的毒性较大，故选用乙醚做为萃取剂。

2.3.2萃取剂用量考察

取含待测物标准品的尿液样本0.5 mL，用磷酸缓冲液调样本至pH=8后，分别在0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL和0.4 mL和0.5 mL的乙醚条件下超声震荡萃取，离心后取上清液进行GC-MS检测，以峰面积作为评价指标。结果显示，当乙醚用量低于0.2 mL时，由于其易挥发致其略有损耗，量太少不能有效地提取待测物，当用量高于0.2 mL以后，待测物提取效率则有缓慢下降的趋势，从而说明在一定浓度范围内，提取效率会随着溶剂体积的增加而降低，但萃取剂量过低时也会造成提取不充分。

2.3.3萃取溶液酸碱度考察

本次实验的待测物为百草枯的还原产物，属弱碱性物质，因此，既需考虑提取时溶液的pH值，又需考虑百草枯进行还原反应时所需的pH值，百草枯及其还原产物在碱性条件下，有利于减少其在基质中的电离度和溶解度，易于反应与提取，但碱性过高时不稳定易分解，为此，我们考察了pH=7，8，9，10的条件下反应产率及萃取效率，实验发现当pH=8时，还原反应发生完全，并且萃取效率较高，故以pH=8做为溶液的萃取酸碱度。

2.4方法学考察

2.4.1线性范围及检测限

取空白尿液检材5份，添加百草枯标准品及内标物，配制成系列浓度含内标物标准品的尿液样本，按以上实验步骤进行样本提取与检测，以待测物与内标物浓度比值为横坐标，以待测物与内标物两者的峰面积比值为纵坐标，得其线性方程、相关系数 r及最低检出限(检测时信噪比为3S/N)，如表1所示。结果表明，待测物在0.1 μg/mL～50 μg/mL范围内线性关系良好。

2.4.2精密度考察

在线性方程范围内，按高、中、低3个浓度点分别添加待测物与内标物，制作5个平行检材样本，并按以上操作步骤提取并检测，分别进行日间及日内精密度考察。结果如表2所示。

表1　线性关系、相关系数及检出限(3S/N)

表1中Y表示待测物与内标物色谱峰面积比值，X表示待测物与内标物浓度比值

表2　添加不同浓度标准品样本的精密度试验结果(n=5)

2.4.3加样回收实验

按上述实验方法，在空白尿液中添加不同浓度的百草枯标准品，进行加样回收实验，结果如表3所示。

表3　添加不同浓度标准品样本回收率试验结果(n=5)

2.5样品分析

取1例疑似百草枯中毒案件受害者的尿液样本，按本文上述实验方法进行检测，测得该尿液样本中的百草枯含量为1.12 μg/mL。

3结论

本文建立了可行的尿液中百草枯还原产物的液相小体积提取-GC-MS检测方法，并对还原与萃取条件进行了方法学考察，该方法简单、方便、检测灵敏度高，能满足公安机关对此类中毒案件检测的需求，对此类案件的侦破提供确凿的证据。

参考文献

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[4]刘萍，邬春华，邓力行等. 生物样本中百草枯检测方法研究进展[J]. 环境与职业医学, 2010, 27(9): 563-565

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[7]王燕燕，孟品佳. 唾液中苯丙胺类毒品的液相小体积萃取GC/MS-SIM检测[J]. 化学通报, 2009(5):449-453.

[8]孟品佳，王燕燕，朱丹. 生物样品中苯丙胺类毒品的小体积液相萃取及 GC /MS分析[J]. 应用化学, 2008, 25(12):1448-1452.

(责任编辑于瑞华)

中图分类号D918.93

作者简介周晓英(1976—)，女，重庆潼南人，硕士，讲师。研究方向为微量物证、痕迹物证鉴定。

基金项目四川省公安厅理论与软科学项目(2011-22)。