樱桃谷肉鸭“大舌病”研究简报*

于可响，黄兵，马秀丽，刘存霞，胡峰，李峰，宋敏训

（山东省农科院家禽研究所禽病研究中心，山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室，山东济南250023）

樱桃谷肉鸭“大舌病”研究简报*

于可响，黄兵，马秀丽，刘存霞，胡峰，李峰，宋敏训**

（山东省农科院家禽研究所禽病研究中心，山东省家禽疫病诊断与免疫重点实验室，山东济南250023）

2014年下半年以来，我国江苏、山东、安徽、河北、江西等主要养鸭地区的樱桃谷肉鸭中暴发了一种以喙短、舌长、骨脆、发育不良为主要临床特点的疾病，生产中称为“大舌病”或“长舌病”，给当地的肉鸭养殖造成了很大的冲击。我们从山东地区发病鸭中分离到一株能在番鸭胚和鹅胚繁殖的病毒（命名为YZ15-1），经PCR鉴定，确定为小鹅瘟病毒。VP3基因系统进化树显示，YZ15-1与GPV处于同一个分支，特别与GPVa2006和GPVb1999这两个台湾分离株的遗传关系最近。流行病学调查发现，出现大舌症状的鸭子体内均能检测GPV，泄殖腔棉拭子的阳性率为78.8%；而发病鸭群中未出现大舌症状的鸭子体内病毒检测的阳性率为58.3%，泄殖腔棉拭子的阳性率为37.5%；同时从10个不同地区健康鸭群采集的100份泄殖腔棉拭子中未检测到GPV。但是肉鸭回归试验未复制出“大舌”症状。这些结果说明，鸭“大舌病”可能是以变异的GPV为传染性因素，其他辅助性因素共同作用的结果。

樱桃谷鸭；鸭“大舌病”；小鹅瘟病毒；变异。

2014年下半年开始，在江苏省沛县及周边养殖的商品樱桃谷肉鸭中开始出现一种以喙短、舌长、骨脆、发育不良为主要临床特点的疾病，生产中称为“大舌病”或“长舌病”，实际上此命名并不准确，患鸭是由于喙发育慢而使得舌头突出在外，并不是舌头变长。随后该病逐渐蔓延到山东、河北、河南、安徽、江西等主要养鸭地区。病鸭最早可在6日龄出现舌头突出的症状，随后每天都会出现且新发病鸭的数量逐渐增多。病鸭在发病后期喙比正常鸭要短10%～30%，并且一旦发病很难恢复正常。剖检病鸭发现，除了肠道炎症外，无明显的病变。该病的发病率差别很大，低的不到0.5%，高的可达30%，个别的可达70%。一般在5%～20%。该病刚开始发生于商品代樱桃谷肉鸭，后来波及肉种鸭和番鸭。国内研究人员已证实该病是由细小病毒引起，并将其称为“鸭短喙长舌综合征”或“鸭短喙和侏儒综合征”[1-2]。由于舌头突出，导致病鸭无法正常采食，因此病鸭常表现发育不良，腿、翅膀易断，很多屠宰场拒收此类残鸭，使得养殖户损失严重。目前，该病有愈演愈烈的趋势，需要引起足够的重视。

1 材料与方法

1.1 病料采集本研究的病料来自于山东省兖州市某肉鸭养殖场21日龄的有“大舌”症状的病鸭。该养殖场从5日龄开始陆续出现腿瘸、喜卧、生长发育迟缓的病鸭，10日龄左右开始出现舌头突出喙外的病鸭。

1.2 病毒分离无菌采集发病鸭的脾脏，加入5倍体积PBS（pH 7.2）和终浓度1000U/ml的双抗，剪碎后充分研磨，然后分装、反复冻融2次，3000rpm离心20min，取上清经菌检无菌后分别接种9日龄SPF鸡胚、10日龄SPF鸭胚、10日龄肉鸭胚、10日龄番鸭胚和12日龄鹅胚，0.1ml/枚。收集接种后2～6d死亡的胚胎尿囊液或接种后6d未死的胚胎尿囊液，继续盲传5代，观察并记录接种胚胎死亡及病变情况，收集疑似病毒的尿囊液和胚胎冻存备用。分离的毒株命名为YZ15-1。

1.3 病毒鉴定

1.3.1 血凝特性按常规方法进行血凝试验，分别测定分离毒对鸡、鸭、鹅、鸽、鼠和兔红细胞的血凝性。

1.3.2 PCR鉴定根据NCBI中已发表的小鹅瘟病毒（GPV）YZ99-6株的序列（登录号：KC996730），设计一对特异性引物用于GPV的检测。引物序列为：上游引物P1：5' CTTGAACACGACAAGGCC3'；下游引物P2：5 'GTCGGTAAGCTTCCCTGTATTT3'，预期扩增片段大小为234bp，引物由上海立菲生物技术有限公司合成。

提取鹅胚分离毒的RNA，分别用A型鸭肝炎病毒（DHV-A）、C型鸭肝炎病毒（DHV-C）、番鸭呼肠孤病毒（MDRV）、新型鸭呼肠孤病毒（NDRV）、鸭坦布苏病毒（DTMUV）的特异性引物进行RT-PCR鉴定；提取鹅胚分离毒的DNA，分别用鸭肠炎病毒（DEV）、番鸭细小病毒（MDPV）、鹅细小病毒（GPV）的特异性引物进行PCR鉴定。

1.4 VP3基因分析根据NCBI中已发表的GPV YZ株的序列（登录号：KR091960），设计一对引物用于扩增病毒的主要抗原基因-VP3基因。引物序列为：上游引物P1：5'CGGGAGGTGGCAGTAGTG 3'；下游引物P2：5'CGCCAGGAAGTGCTTTATT 3'，预期扩增片段大小为1716 bp，引物由上海立菲生物技术有限公司合成。

提取病毒的DNA，按照常规PCR方法进行扩增。取5μl反应产物在1.5%琼脂糖中电泳进行检验。按照DNA凝胶回收试剂盒说明回收PCR产物，与pMD18-T载体连接后，转化DH5ɑ。挑菌提取质粒，分别进行PCR和酶切鉴定，鉴定为阳性的菌落送上海立菲生物技术有限公司进行测序，并与GenBank中发表的相关序列进行比较。

从NCBI中获取GPV和MDPV的VP3基因序列（表1），通过MEGA软件将YZ15-1的VP3基因序列与GPV、MDPV做比对，并绘制系统进化树。

表1 本研究所选用毒株的背景

1.5 流行病学调查收集山东省的齐河、高唐、兖州、嘉祥、安丘、单县、青州、沂南、东阿、临邑、阳谷等11个地区、157份发病鸭群的泄殖腔棉拭子或病料，其中有大舌症状的病料35份、棉拭子70份；无大舌症状的病料12份、棉拭子30份；另外收集了10个地区的健康鸭的泄殖腔棉拭子100份，利用PCR方法进行检测。

1.6 肉鸭攻毒试验1日龄樱桃谷肉鸭90只，经琼脂扩散试验检测无相应的母源抗体。分别用鹅胚分离毒和发病鸭脾脏病料通过肌肉注射（0.5ml/只）加口服（1ml/只）的方式感染，30只/组，同时设空白对照组30只，观察并记录实验鸭发病及死亡情况，并于试验结束后对实验鸭进行称重。

2 结果

2.1 病毒分离通过番鸭胚和鹅胚分离到一株对胚胎有致死性的病毒，我们命名为YZ15-1。初次分离时，胚胎均未出现死亡，从第3代开始，少部分番鸭胚和鹅胚胚胎出现死亡，死亡时间集中在接种后4～6d，死亡胚胎表现为绒毛尿囊膜水肿，胚胎头部、翅、趾有出血点。而通过SPF鸡胚、SPF鸭胚和肉鸭胚未分离到对胚胎有致病性的病毒。尽管病毒能在番鸭胚和鹅胚繁殖，但病毒滴度普遍不高。

2.2 病毒鉴定

2.2.1 血凝特性该分离毒对鸡、鸭、鹅、鸽、鼠和兔红细胞均无血凝性。

2.2.2 PCR鉴定利用几种常见鸭病毒病的特异性引物对分离毒株进行PCR鉴定，检测结果显示，只有鹅细小病毒为阳性。

2.2.3 VP3基因分析通过测序发现，YZ15-1的VP3基因长1605bp，与GPV、MDPV的VP3基因长度一致。通过DNAStar软件将YZ15-1的VP3基因序列与GPV和MDPV相比对，我们发现YZ15-1的VP3基因序列与GPV的同源性最近，达到93.1%～98.2%；与MDPV的同源性为81.5%～91.4%。通过MEGA软件绘制了VP3基因的系统进化树（图1），结果显示，YZ15-1与GPV处于同一个分支，特别与GPVa2006和GPVb1999这两个台湾分离株的遗传关系最近。

图1 水禽细小病毒VP3基因系统进化树

2.3 流行病学调查采集11个地区的129份发病鸭群的泄殖腔棉拭子或病料，通过PCR方法进行检测，结果发现，出现大舌症状的鸭子体内均能检测GPV（27/27），而泄殖腔棉拭子的阳性率为78.8%（52/66）；而发病鸭群中未出现大舌症状的鸭子体内病毒检测的阳性率为58.3%（7/12），泄殖腔棉拭子的阳性率为37.5%（9/24）。同时从10个不同地区健康鸭群采集的100份泄殖腔棉拭子中未检测到GPV。

2.4 雏番鸭攻毒试验分别用鹅胚分离毒和发病鸭脾脏病料回归1日龄雏鸭，观察至35日龄，实验鸭未出现死亡，也未发现有“大舌”症状。但鹅胚分离毒攻毒组和脾脏病料攻毒组的平均体重分别比正常对照组降低4.25%和9.32%。

3 讨论

水禽的细小病毒病主要有番鸭细小病毒病和鹅细小病毒病（小鹅瘟），这两种病毒在形态特征、理化特性、基因组结构等方面非常相似[3]。两者具有一定的抗原交叉保护性，它们的共同抗原主要在核衣壳蛋白VP3，而VP1和VP2蛋白存在抗原性差异[4]。自然条件下，番鸭细小病毒只能感染番鸭，不能感染鹅，而鹅细小病毒不仅可以感染鹅，还可以感染番鸭。这两种病毒病主要感染雏番鸭或雏鹅，以发病率高、死亡率高为主要特征[5]，与此次在肉鸭中流行的“大舌病”在发病特点上有很大的不同。

通过基因序列和抗原性分析，可以确实该病的病原实际上就是小鹅瘟病毒，只是因为宿主细胞受体结合部位的某个或某些位点的氨基酸变异，使其获得了感染樱桃谷肉鸭的能力。实际上，类似肉鸭“大舌病”的病例早在20世纪70年代法国的半番鸭中就开始出现，称为“短喙和侏儒综合征”，之后台湾、波兰也有类似病例的报道[6-7]。在我国南方的番鸭养殖中，时常会发现一些因感染过番鸭细小病毒而出现类似症状的“僵鸭”。近几年来，山东个别肉鸭养殖户在养殖过程中也会发现极少数类似的“残鸭”。这些都说明了水禽细小病毒一直在“努力”地变异着，直到最近两年完全获得感染肉鸭的能力，从而导致了该病的大暴发。

我们用鹅胚分离毒和病鸭病料对无母源抗体的樱桃谷肉鸭总共进行3次回归实验，试验过程中采取了加大感染剂量、使用不同的感染方式、采用不同发病场的患鸭病料、选用不同种鸭场的雏鸭、口服环磷酰胺人为降低实验鸭的免疫力、人为制造冷应激等多种措施，但都未复制出“大舌”症状。尽管有研究报道该病可以在樱桃谷肉鸭中复制出临床症状[1-2]，但我们的回归试验至少说明该病较难复制，可能需要其他病原或协同因素的共同作用。

关于鸭“大舌病”传播方式目前尚不明确。可以确定的是，其横向传播能力有限。该病刚开始流行时，生产中常常出现相距不足20m的两栋鸭舍，一栋舍的鸭群发病，另一栋舍不发病的情况。通过走访调研，我们发现该病发病有愈来愈早的趋势，目前大多数感染发生在7日龄内。这可能存在两种传播方式。第一种是垂直传播，由于GPV和MDPV都有垂直传播的特点，因此该病存在垂直传播的可能性。但临床中也会出现同一种鸭场的同一批鸭苗在同一地区进行饲养，有的养殖场发病，有的养殖场不发病的情况，这似乎与垂直传播相矛盾；第二种可能性是病毒一直在养殖场中存在，鸭苗一进场即被感染。这种可能性非常大。因为通常一个养殖场会出现连续多批发病的情况。另外，临床实践证实，空栏期加强消毒，能大大降低下一批鸭的发病率。

总之，肉鸭“大舌病”作为一种新发疫病，其致病机理、变异机制、免疫机制、传播途径、防控措施等多个方面还需要进一步的研究。

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S858.32

B

1673-1085（2016）03-0013-04

2016-02-21

山东省现代农业产业技术体系家禽创新团队计划（SDAIT-13-011-01）；山东省海外高层次人才（泰山学者）引进计划。

作者：于可响，男，博士，副研究员。E-mail：yukx1979@163.com。

**通讯作者：宋敏训，博士，研究员，E-mail：mxsong@aliyun.com。