益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠行为学及海马病理和神经元凋亡的影响

2016-05-19王清碧广西中医药大学附属瑞康医院530011南宁市华东路10号吴广西中医药大学第一附属医院530023赵清山马鞍山市中医院243021李天威李海沅广西中医药大学第一附属医院530023蔡鑫昆盐城市中医院224001毕信亚防城港市中医院538021唐农广西中医药大学第一附属医院530023

广西中医药 2016年2期

关键词：记忆能力血管性痴呆学习能力

王清碧　广西中医药大学附属瑞康医院　530011南宁市华东路10号吴　林　广西中医药大学第一附属医院　530023赵清山　马鞍山市中医院　243021李天威　李海沅　广西中医药大学第一附属医院　530023蔡鑫昆　盐城市中医院　224001毕信亚　防城港市中医院　538021唐　农广西中医药大学第一附属医院　530023

王清碧广西中医药大学附属瑞康医院530011南宁市华东路10号
吴林广西中医药大学第一附属医院530023
赵清山马鞍山市中医院243021
李天威李海沅广西中医药大学第一附属医院530023
蔡鑫昆盐城市中医院224001
毕信亚防城港市中医院538021
唐农*广西中医药大学第一附属医院530023

摘要目的：观察益肺宣肺降浊方对血管性痴呆大鼠行为学及海马病理和神经元凋亡的影响。方法：采用双侧颈总动脉夹闭再通法制备痴呆模型，随机分为模型组、石杉碱甲组、中药高剂量组、中药中剂量组和中药低剂量组（注：中药为益肺宣肺降浊方）。药物治疗30 d后，采用Morris水迷宫实验观察大鼠的学习、记忆能力，光镜下观察大鼠海马CA1区的病理变化，用TUNEL法检测神经细胞凋亡。结果：在定位航行试验中，中药3个组的平均潜伏期较模型组明显缩短，与模型组比较有统计学差异（P＜0.01）。在空间探索实验中，中药3个组与模型组比较，成功次数差异均具有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，各中药组大鼠海马CA1区神经细胞坏死、变性和凋亡明显减轻。结论：益肺宣肺降浊方具有改善痴呆大鼠学习、记忆能力及减轻海马损伤和神经元凋亡的作用。

关键词益肺宣肺降浊方；血管性痴呆；学习能力；记忆能力；病理；神经元凋亡

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由各种脑血管病引起的获得性、持续性智能损害综合征，临床中最突出的表现是学习和记忆等认知功能的下降。在发达国家中VD占全部痴呆患者的25%～50%，成为导致痴呆的第二大原因［1］。在所有的痴呆类型中，从某种程度上讲，血管性痴呆是可以防治的［2］。伴随着医疗技术水平的提高以及老龄化社会的到来，血管性痴呆的发病率越来越高，一方面给老年患者的身心健康带来严重的危害，另一方面也给家庭和社会带来沉重的经济和精神负担，因此，预防和治疗血管性痴呆将会受到越来越多人的关注。笔者参照吕氏造模方法［3］实验，用两侧颈总动脉夹闭再通法制备VD模型，用Morris水迷宫观察益肺宣肺降浊方对VD大鼠学习和记忆能力的影响，用苏木精-伊红染色法（hematoxylineosin staining，HE）观察海马CA1区病理变化，用TUNEL法检测神经细胞凋亡，现将实验结果报道如下。

1　实验材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物SPE级SD雄性大鼠190只，体重200±20 g，由湖南斯南莱克景达实验动物有限公司提供（No：43004700002251）。

1.1.2主要实验药品及试剂益肺宣肺降浊方免煎颗粒（黄芪15 g、人参15 g、麦冬15 g、桔梗10 g、杏仁10 g、三七15 g、苏子15 g、石菖蒲15 g、酒大黄6 g）由广西中医药大学第一附属医院提供，4℃保存备用，使用时用双蒸水稀释成适当浓度。石杉碱甲片（双益平）由上海复旦复华药业有限公司提供，国药准字H10960133。

1.2造模及筛选实验动物术前8 h禁食，用10%水合氯醛按照3 ml/kg标准行腹腔注射麻醉。所有的手术器械先给予高温灭菌，固定好大鼠，然后颈部去毛，碘伏消毒后，行颈正中切口，依次应用玻璃分针分离出双侧颈总动脉并用0号丝线结扎，手术过程中注意不要牵拉迷走神经，阻断血流20 min，同时在大鼠距尾尖1 cm处断尾，放血约0.3 ml，然后松开丝线恢复大脑血流10 min，再次阻断血流20 min，如此重复3次，即以三次缺血20 min、再灌注10 min的方式造成VD模型。第3次血流再灌注后，切口给予适量头孢粉末预防感染，随即缝合皮肤，放回笼中正常饲养。空白组只分离双侧颈总动脉不结扎也不阻断［3］。造模成功后运用水迷宫实验进行VD模型筛选（经过模型筛选纳入实验的动物122只），Morris水迷宫（MWM）参照相关文献制作［4］，模型筛选参照赵宪林等［5］的VD大鼠模型筛选标准进行。

1.3分组及给药将造模成功大鼠随机分为中药高、中、低剂量组，石杉碱甲组，模型组，每组20只，空白组22只。造模第20 d开始灌胃给药，给药量均按人与大鼠体表面积系数比确定，以临床人用药等效剂量做为中剂量，益肺宣肺降浊方高、中、低剂量组大鼠的给药剂量分别为24.36 g/（kg·d）、12.18 g/（kg·d）、6.09 g/（kg·d），石杉碱甲给药剂量为0.15 mg/（kg·d）。给药浓度折算至每天按1 ml/100g大鼠体重灌胃，模型组及空白组均予相应体积的双蒸水。每天给药1次，30 d后采用Morris水迷宫实验进行学习和记忆能力检测。

1.4取材、HE染色及神经元凋亡检测方法行为学测试结束后，用10%的水合氯醛按照0.3 g/kg的标准行腹腔注射麻醉，快速开胸暴露大鼠心脏，剪开右心耳，夹持心尖，将粗针头经左心室插入升主动脉，用动脉夹将针头固定。快速滴入37℃生理盐水100～250 ml冲洗大鼠体内血液，直至右心耳处流出浅白色液体或基本澄清。随即灌注4℃4%多聚甲醛，先快速灌入约30 s，然后缓慢灌注，直至大鼠头部变硬，四肢震颤停止即结束灌注。然后，立即断头取脑，分离出双侧海马放入4%多聚甲醛中固定。然后经脱水、浸蜡、包埋、连续冠状切片，片厚约5 μm，采用HE染色观察组织形态，TUNEL法检测海马区神经细胞调亡。

2　统计学处理

所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料用“均数±标准差”表示，3组或以上计量资料比较用单因素方差分析，所有的统计检验均采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3　结　果

3.1各组学习成绩比较见表1。从表1可见，经过益肺宣肺降浊中药方治疗后，VD大鼠的学习成绩明显改善，且在一定的中药剂量范围之内，学习成绩与中药剂量正相关。

3.2各组记忆成绩比较见表2。从表2可见，模型组大鼠记忆行为能力明显受损，而益肺宣肺降浊方对VD模型大鼠有一定程度的保护作用，并且中药各组之间存在一定的量效关系。

表1　各组学习成绩比较

表2　各组记忆成绩比较

3.3 HE染色光镜下观察大鼠海马组织病理形态学结果见图1。海马组织常规石腊切片，HE染色后，细胞核呈蓝色，细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色。光镜下可见空白组大鼠海马CA1区锥体细胞排列紧密、整齐，细胞形态完整、轮廓清晰，细胞核结构清楚，核仁圆润、清晰。中药高剂量组、石杉碱甲组与空白组比较差异较小，其余各组存在不同程度的差异。

图1　各组HE染色结果比较（×20）

3.4 TUNEL法检测大鼠海马神经细胞凋亡情况结果见图2及表3。各组随机取6只大鼠标本用于神经元凋亡检测，其中神经元凋亡（TUNEL阳性细胞）以绿色荧光表示，空白组偶见阳性细胞，仅有少量细胞凋亡；模型组阳性细胞明显增多，簇拥成团状；中药高剂量组及石杉碱甲组与空白组比较未见明显差别，其余各组存在不同程度的差异。

图2　各组神经元凋亡（绿色荧光）结果比较（×20）

4　讨　论

石杉碱甲是从中药材中提取出来的天然植物碱，作为一种可逆性胆碱酯酶抑制剂，临床和实验研究表明其具有提高认知功能、增强记忆保持和促进记忆再现的作用。本实验选择石杉碱甲作为对照药物，并且把中药组分为高、中、低剂量组，是为了进一步证明益肺宣肺降浊方对血管性痴呆的治疗作用。从检测的记忆属性来看，Morris水迷宫试验可以用于筛选VD的有效防治药物［6-7］，其中最常用的评价指标是定位航行实验的“逃避潜伏期”（占48．48%），其次是空间探索实验的“跨越平台次数”（占27．27%）［8］。本实验研究结果说明益肺宣肺降浊方具有改善痴呆大鼠学习记忆能力及减轻海马损伤和神经元凋亡的作用，且中药在一定的剂量范围内，随着剂量的增加疗效更显著。

表3　TUNEL法检测各组大鼠海马神经细胞凋亡数目　（±s）

注：与空白组比较，①P＜0.01；与模型组比较，②P＜0.01；与石杉碱甲组比较，③P＜0.01；与中药高剂量组比较，④P＜0.01

组别　n　　神经细胞凋亡数目空白组　6　19.16±11.58模型组　6　118.33±31.41①中药高剂量组　6　26.66±10.32②中药中剂量组　6　49.16±11.58①②③④中药低剂量组　6　71.66±10.80①②③④石杉碱甲组　6　30.00±14.14②

血管性痴呆在传统中医中没有专门的论述，纵观血管性痴呆历年的研究成果，在病因病机的认识上，比较一致的看法是，其发病病位在脑，病机为本虚标实，本虚为脏腑亏损，气不足，尤与心肝脾肾亏虚关系密切，标实为痰阻、血瘀、浊毒，而很少提及到肺脏，这不能不说是一个缺陷。早在上世纪90年代，我校唐农教授首先提出“脑病从肺论治”观点，本研究的益肺宣肺降浊方是依据“从肺论治痴呆”的新观点拟定的经验方，前期的临床实践已证实其具有良好的疗效［9-12］。表明肺脏虚损在VD发生发展过程中同样起着重要的作用。

痴呆病的特征是记忆的不同程度丧失，而记忆的丧失实际上是肾的“藏纳”功能障碍，即收藏不利，则直接影响到信息的存储。而肾之“藏”是以肺之“收”为前提条件的，肺是启动记忆存储过程的关键环节。标实方面，“瘀痰”的发生是气血津液运行失调的表现，“瘀”与肺的关系不必多言，“肺朝百脉”一言以蔽之。“痰浊”则主要与肺、脾、肾三脏功能直接相关，“浊毒”则与“腑滞”相关。肺与大肠相表里，二者协调配合，共同完成气的宣降功能。老年人脏腑功能衰退，肺气不足，宣降失职，大肠传导失司，糟粕滞留肠腑，产生浊毒，清气不升，浊阴不降，上扰清窍，从而导致痴呆发生。因此，肺脏虚损在痴呆发生发展过程中是一个不可忽视的环节，在治疗痴呆这一疾病时，重视调理肺气具有重要的临床指导意义［13-17］。

参考文献

［1］Brayne C，Stephan B C，Matthews F E.A European perspective on population studies of dementia［J］. Alzheimers Dement，2011，7（1）：3-9.

［2］Moorhouse P，Rockwood K．Vascular cognitive impairment：current concepts and dinical developments［J］．Lancet Neurol，2008，7（3）l 246-255．

［3］吕佩源，王伟斌，尹昱，等.石杉碱甲对血管性痴呆小鼠额叶皮层和海马cAMP水平的影响［J］.中华神经科杂志，2005，38（5）：325-327.

［4］Gong C X，Liu F，Grundke-lqbal I，et al.Post -translational modifications of tau protein in Alzheimers Disease ［J］.J Neural Transm，2005，112（6）：813．

［5］赵宪林，方秀斌，李东培.大鼠血管性痴呆模型制作［J］.中国医科大学学报，2002，31（3）：166-167.

［6］方松.Morris水迷宫实验中海马相关空间学习记忆的研究进展［J］.国际病理科学与临床杂志，2010，30（4）：321－326．

［7］吕国蔚，李云庆.神经生物学实验原理与技术［M］.北京：科学出版社，2011：340-345．

［8］陈罗西，郭玲玲，李亮.Morris圆形水迷宫的应用及其相关检测指标分析［J］.辽宁中医药大学学报，2008，10 （8）：55-57.

［9］唐农，胡跃强，吴林，等.益肺宣肺降浊胶囊对血管性痴呆患者的疗效及脑神经递质的影响［J］.辽宁中医杂志，2014，41（10）：2108-2110.

［10］唐农，胡跃强，吴林，等.益肺宣肺降浊胶囊治疗血管性痴呆的随机对照临床研究［J］.中华中医药杂志，2014，29（12）：3778-3781.

［11］李天威，唐农，赵清山.益肺宣肺降浊方治疗血管性痴呆的临床观察［J］.广西中医药，2014，37（2）：25-27.