复方一枝蒿复合磷脂脂质体的制备及其在Caco-2细胞模型中的吸收特性研究

陈　蕾，姜　雯，曾　诚，潘晓梅，邢建国(新疆维吾尔自治区卫生与计划生育委员会药品采购中心，乌鲁木齐　80000;新疆医科大学第六附属医院药剂科，乌鲁木齐　8000;新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐　80004)



复方一枝蒿复合磷脂脂质体的制备及其在Caco-2细胞模型中的吸收特性研究

陈蕾1，姜雯2，曾诚3，潘晓梅2，邢建国3
(1新疆维吾尔自治区卫生与计划生育委员会药品采购中心，乌鲁木齐830000;2新疆医科大学第六附属医院药剂科，乌鲁木齐830002;3新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐830004)

摘要:目的通过建立体外Caco-2细胞模型，考察复方一枝蒿提取物和复方一枝蒿复合磷脂脂质体的转运机制。方法采用硫酸铵梯度法制备复方一枝蒿复合磷脂脂质体，考察其理化性质，并利用Caco-2细胞模型，研究和评估复方一枝蒿提取物和复方一枝蒿复合磷脂脂质体的肠吸收和转运特征。结果在Caco-2细胞单层模型中，复方一枝蒿复合磷脂脂质体的渗透系数(P(app))与复方一枝蒿提取物对比增加了6倍，复方一枝蒿提取物从apical(A，肠腔面)到basolateral(B，基底面)的(P(app))等于B到A，转运符合被动扩散，通过复合磷脂脂质体包裹后，提高复方一枝蒿提取物透射率(A到B的(P(app))＞B到A的(P(app)))具有一定的主动转运效果。结论通过复合磷脂脂质体包裹复方一枝蒿提取物促进了其跨膜转运，并进一步提高了复方一枝蒿提取物的转运能力。

关键词:复方一枝蒿提取物;复合磷脂脂质体;包封率;Caco-2细胞模型

复方一枝蒿(compound YiZhiHao，CY)是一种常用的抗病毒中成药，临床上主要用于治疗小儿呼吸道病毒性感染［1］。复方一枝蒿处方由新疆一枝蒿、大青叶和板蓝根组成，具有清热解毒、抗菌消炎、抗过敏和治疗感冒等功效［2］。根据维吾尔医理论，其可清除“乃孜来(病毒性感冒)”、解毒利咽，用于“乃孜来”所致的感冒发烧、咽喉肿痛等［3－4］。复方一枝蒿中的主要成分为一枝蒿酮酸，一枝蒿酮酸具有抗病毒、抗炎、抗菌等作用［5］。复方提取物吸湿性强和易潮解，为提高复方一枝蒿的临床疗效和稳定性［6］，采用复合磷脂脂质体技术制备复方一枝蒿复合磷脂脂质体，复合磷脂脂质体(composite phospholipid liposomes，CPL)是近年来涌现出的一项制剂新技术，是一种由2种不同磷脂相间排列和胆固醇组成的类似生物膜结构的拥有不同相区域的磷脂双分子层的球型药物载体，主要特点为在CPL制备过程中采用2种不同相变温度的磷脂(1种高于常温，1种低于常温)，所得制剂能够使药物的生物相容性和生物利用度大幅度上升［7－10］。

本实验采用复合磷脂脂质体包裹复方提取物，并通过建立体外Caco-2细胞模型考察药物的转运机制，使药物在体内具有良好的生物相容性，并在胃肠道中防止药物被降解，从而提高药物的口服生物利用度，为中药复方制剂在口服纳米制剂领域中的应用奠定基础。

1　仪器与材料

1．1实验仪器SPD-10Avp型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，控温加热磁力搅拌器(德国IKA公司)，FIELDA-400S型手提式超声波细胞破碎仪(江苏波杨智能科技股份有限公司)，Nano S90激光粒度仪(英国马尔文公司)。

1．2实验材料复方一枝蒿提取物(由新疆维吾尔自治区药物研究所提供)，大豆磷脂(德国lipoid公司，批号139017)，氢化大豆磷脂(日本精细化工株式公社，批号RKL-MD231)，胆固醇(河南利伟生物药业股份有限公司，批号14116，分析纯)。Sephadex G-50(北京慧德易科技有限责任公司，批号17-0042-02)，透析袋(上海哈灵生物有限公司，截留分子量: 8 000～14 000 u)，乙腈为市售分析纯试剂，水为重蒸馏水。

1．3Caco-2细胞人体结肠癌细胞(the human colon carcinoma cell line)，Caco-2细胞株购于中国医学科学院药物研究所。

2　方法与结果

2．1复方一枝蒿提取物复合磷脂脂质体的制备按9∶1∶1(重量比)将大豆磷脂(SPC)、氢化大豆磷脂(HSPC)和胆固醇溶于2 mL无水乙醇，适当超声使其溶解，注入到磁力搅拌(60℃)的5 mL、0．2 mol/L硫酸铵溶液中，50℃减压回收乙醇5 min，取出，调整体积至25 mL，冰浴探头超声(400 W，150 次)匀化后，低速离心(1 000 r/min，5 min)除去钛粉，用10倍量体积PBS溶液(pH=7．4)透析，每次2 h，共4次，除去外水相硫酸铵，制得空白复合磷脂脂质体。取CYE溶液与空白复合磷脂脂质体混匀，60℃恒温水浴磁力搅拌30 min，冰浴中放置10 min，即得复方一枝蒿提取物复合磷脂脂质体(CYCPL)。

2．2色谱条件COSMOSIL Packed Column 5C18-MS-Ⅱ色谱柱(4．6 mm×250 mm，5μm);流动相:甲醇-0．4%磷酸溶液(55∶45);检测波长:242 nm，流速:1．0 mL/min，柱温35℃，进样量10μL。分别测定一枝蒿酮酸对照品、CYE样品，在此色谱条件下样品中其他成分对一枝蒿酮酸测定无干扰，见图1、2。

图1　一枝蒿酮酸对照品的HPLC色谱图

图2　CYE样品的HPLC色谱图

2．3方法学考察

2．3．1标准曲线的建立建立CYE的HPLC分析方法，标准曲线方程为:Y=35 228．63X+8 407．68 (r=0．999 8，n=5)，一枝蒿酮酸质量浓度在9．024～162．432μg/mL范围内线性关系良好。

2．3．2精密度试验将低、中、高浓度的一枝蒿酮酸标准溶液(10．16、77．548、155．34μg/mL)用HPLC 在242 nm下连续测定5次峰面积，计算日内精密度，分别在5 d内每天用HPLC测定峰面积，计算日间精密度。日内和日间精密度的相对标准偏差(RSD)分别为(1．52±0．14)%、(1．13±0．11)%、(1．47 ±0．18)%和(1．39±0．18)%、(1．22±0．15)%、(1．62± 0．26)%，证明本方法精密度良好。

2．3．3稳定性试验取CYE溶液5份，用HPLC在242 nm下于不同时间点(0、1、2、4、6、8 h)测定峰面积并计算含量。结果RSD=(2．06±0．23)%(n= 6)，证明本方法精密度良好。

2．3．4加样回收率试验精密吸取已知浓度(3．85μg/mL)的CYE溶液1 mL，精密加入1 mL不同浓度(5．24、70．35、140．70μg/mL)的一枝蒿酮酸标准溶液混匀，用HPLC法测定峰面积并计算含量和加标回收率。一枝蒿酮酸高、中、低浓度的加样回收率分别为(99．08±1．04)%、(99．54±0．85)%、(98．55±1．22)%，RSD分别为(0．93±0．12)%、(0．86±0．14)%、(1．34±0．22)%，均符合要求。

2．4 CYCPL的粒径、zeta电位和形态观察精密移取CYCPL 0．05 mL，用5倍水和介质稀释，采用Nano S90激光粒度仪测定粒径和zeta电位。同时，采用2%磷钼酸纳负染色制备样品(样品用水和介质稀释10倍)，在透射电镜下观察其形态与分布。

取CYCPL，用激光粒度仪测定其粒径大小、分布和zeta电位，所得CYCPL平均粒径为(147．7±4．8)nm，分散系数PDI为(0．151±0．038)，表明CYCPL粒径适中，分布均匀，分散性良好(图3)，所测Zeta电位为-18．36 mV。

图3　CYCPL的粒径分布图

采用磷钨酸负染法，用透射式电子显微镜观察CYCPL形态。将适当稀释后的待测复合磷脂脂质体滴于Formwan膜铜网上(膜面向上)，5 min后，用滤纸片从铜网边缘吸干多余液体。然后向铜网上滴加1%磷钨酸染液，1 min后，同样吸干多余液体。将此铜网晾干后放入透射电镜观察，在镜下可见CPL呈圆球型且呈单分散分布，具有明显双分子层结构，粒径范围小于180 nm，分布均匀(图4)。

2．5包封率的测定精密吸取CYCPL 3 mL上SephadexG-50柱(内径1 cm，长度27 cm)，用pH 7．4的磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱，流速为1 mL/min，收集含药复合磷脂脂质体，取同一批CYE用PBS溶液(pH=7．4)按1∶3比例稀释，分别用HPLC进样10 μL测定其峰面积，并代入线性方程计算复合磷脂脂质体中药物含量和总药物含量。

包封率(EE%)=复合磷脂脂质体中药物含量/总药物含量×100%

2．6 Caco-2细胞培养人体结肠癌细胞Caco-2细胞传至16～22代，在37℃、5%CO2的环境中培养Caco-2细胞，培养基采用DMEM(含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸和青霉素-链霉素双抗液)。培养液3 d更换1次，3 d达到融合。用胰酶(0．25%)-EDTA(1 mmol/L)在37℃条件下消化，细胞接种按浓度80 000个/cm2转移到12孔Transwell板上，在细胞肠腔侧(AP)加入0．5 mL细胞培养液，在基底侧(BL)加入1．5 mL无细胞的培养液。2 d换1次液，10 d后每天换1次液，在细胞培养到20 d时，测定Caco-2细胞单层的跨膜电阻(TEER)。TEER值＞450Ω，表明其具有足够的紧密连接与完整性，见图5。

图4

图5　Caco-2细胞单层形态图

2．7 CYE和CYCPL的转运实验取已建模成功的Caco-2细胞板，吸去肠腔侧(AP侧)和基底侧(BL侧)的细胞液，向AP侧和BL侧分别加入0．5 和1．5 mL HESS平衡盐溶液(pH 7．4)，放入培养箱中30 min后取出，移去平衡盐溶液。向AP侧分别加入0．5 mL CYE和CYCPL。同时，在BL侧加入1．5 mL的平衡盐溶液作为接受介质。给药后于1、5、15、30、45、60、120、180和240 min在BL侧取样0．5 mL供HPLC测定，之后及时补充等体积的平衡盐溶液，转运指标为表观渗透系数(Papp)，公式如下:Papp=dQ/dt/(A×C0)，式中dQ/dt为渗透速率(μg/s)，C0为Caco-2细胞AP侧初始质量浓度(μg/mL)，A 为Transwell的表面积(cm2)。

2．8 CYE和CPL细胞毒性研究CYE和CPL在10～300μg/mL浓度范围内，对Caco-2细胞无明显细胞毒性，细胞存活率均＞95%，见图6。

2．9 Caco-2细胞的转运试验取CYE溶液和CYCPL分别加入Transwell的AP侧和BL侧，分别测定AP-BL和BL-AP的(Papp)，结果CYCPL的(Papp) 与CYE溶液对比增加了6倍，同时CYE溶液的主要转运机制为被动扩散，CYCPL除被动扩散以外，还具有一定主动扩散效果，见表1。

图6　CYE和CPL对Caco-2细胞毒性影响

3　讨论

CPL是一种类似生物膜结构的磷脂双分子层的球型药物载体，由于其双分子层中形成2种不同相区域，使双分子层分隔成多个不连续的区域，抑制了难溶性药物的互相聚集，从而提高了药物在脂质体中的稳定性，并同时存在相分离，这便导致了脂质体膜表面产生区块结构，从而增加了膜通透性，使得CYE可能更容易通过CPL膜进入内水相，提高了药物的载药量［11］。在当今中药药剂学领域，采用复合磷脂脂质体技术的特点，解决中药中成分多而复杂且用量大等问题，尤其对中药有效部位和提取物脂质体的制备具有更加深远的意义。因此，本课题将SIHE制成复合磷脂脂质体，拟开发新型纳米给药制剂，并且希望此技术得到更好的改进，更加广泛地应用于医药领域。Caco-2细胞的结构和生化作用类似于人小肠上皮细胞，并含有与刷状缘上皮细胞相关的酶系(碱性磷酸酶、蔗糖酶、葡糖醛酸酶和磺基转移酶等)［12］。在体外培养一定时间后能够分化具有小肠微绒毛结构，被广泛应用于药物吸收机制的研究［13－14］。［J］．中国实验方剂学杂志，2013，19(5):66-70．

表1　各组药物的转运实验结果

［4］姜雯，何承辉，薛桂蓬，等．Box-Behnken中心组合设计优化复方一枝蒿滴丸成型工艺［J］．中草药，2013，44(9):1134-1140．

［5］黄雁萍，米热古丽．复方一支蒿颗粒治疗小儿上呼吸道感染疗效观察［J］．中国现代药物应用，2009，3(16):144-145．

［6］欧晟，张阳德．复方一枝蒿-壳聚糖纳米药物的制备及其体外抗菌作用的研究［J］．中南大学学报:医学版，2008，33(5): 370-373．

［7］曾诚，黄伟，何承辉，等．复合磷脂脂质体的研究进展［J］．国际药学研究杂志，2015，42(1):91-95．

［8］Li YH，Wang J，Gao Y，et al．Relationships between liposome properties，cell membrane binding，intracellular processing，and intracellular bioavailability［J］．AAPS J．2011，13(4):585-597．

［9］张秀珍．白藜芦醇复合磷脂脂质体的制备及其体外抗肿瘤作用研究［D］．长沙:中南大学，2013．

［10］Mufamadi MS，Pillay V，Chonnara YE，et al．A review on composite technologies for specialized drug delivery［J］．J Drug Deliv，2011:939-941．

［11］邓长弓，钱学华．脂质体介导反义核苷酸转染骨肉瘤细胞后Survivin与VEGF表达的相互影响［J］．川北医学院学报，2009，24(5):432-435．

［12］Li XY，Chen D，Le CY，et al．Novel mucus-penetrating liposomes as a potential oral drug delivery system:preparation，in vitro characterization，and enhanced cellular uptake［J］．Int JNanomedicine，2011，6:3151-3162．

［13］郭健新，平其能，董隽，等．醋酸亮丙瑞林脂质体及壳聚糖包衣脂质体经肠道及Caco-2细胞转运机制［J］．药学学报，2005，40(1):65-70．

［14］黄志巧，邢建国，王新春，等．田蓟苷在Caco-2细胞模型中的吸收特性研究［J］．中国中药杂志，2012，37(9):1315-1318．

［15］Shi LL，Cao Y，Zhu XY，etal．Optimization of process variables of zanamivir-loaded solid lipid nanoparticles and the predication of their cellular transport in Caco-2 cellmodel［J］．Int JPharm，2014，478:60-69．

［16］Singh RS，Michel D，Das U，et al．Cytotoxic 1，5-diaryl-3-oxo-1，5-pentadienes:an assessmentand comparison ofmembrane permeability using Caco-2 and MDCK monolayers［J］．Bioorg Med Chem Lett．2014，24:199-202．

(本文编辑施洋)

根据目前研究，药物的主要吸收机制有2种，一种是存在于小肠肠壁上皮细胞细胞膜的Na+依赖葡萄糖转运载体1可能参与药物的转运。而另一种机制是存在于哺乳动物小肠绒毛边缘的乳糖酶-根皮苷水解酶参与水解至少一部分药物［15］。Singh等［16］报道，人体完全吸收的药物的Papp＞1×10－6;吸收在10%者Papp介于1×10－6与1×10－7之间;吸收1%者＜1×10－7。本实验通过Caco-2细胞转运实验得出CYE溶液的AP-BL侧的Papp为8．5×10－7cm/s，BLAP侧的(Papp)为8．2×10－7cm/s，表明CYE的口服吸收较差，而Papp(AP-BL)/Papp(BL-AP)为1．04，表明CYE溶液的主要转运机制为被动扩散。同时，CYCPL的Papp(AP-BL)/Papp(BL-AP)为1．79，比值＞1．5，表明除了被动扩散之外，可能还存在载体媒介转运。在Caco-2细胞单层膜上，CYE的透射率随吸收促进剂的能力而定，而结果表明CPL有利于促进CYE经细胞旁路跨膜转运。当用CPL包裹CYE之后，细胞间的跨膜电阻明显下降，CYE的跨膜转运增加(主要增加细胞旁路的通透性)，表明CYCPL具有保护和促渗作用，可促进CYE的口服吸收。

参考文献:

［1］刘勇民．一枝蒿［M］．乌鲁木齐:新疆人民出版社，1986:79．

［2］张洁，顾政一，何承辉．HPLC法同时测定新疆一枝蒿中木犀草素和一枝蒿酮酸的含量［J］．中国实验方剂学杂志，2009，15 (4):1-4．

［3］姜雯，姚华，薛桂蓬，等．复方一枝蒿速释微丸的提取工艺优选

Preparation of Co．YiZhiHao com posite phospholipid liposomes and
investigation of its intestinal transportation on Caco-2 cellmonolayer model

CHEN Lei1，JIANG W en2，ZENG Cheng3，PAN Xiaomei2，XING Jianguo3
(1Center for Drug Procurement of Health and Family Planning Commission of the Autonomous Region，Urumqi 830000;2Department of Pharmacy，The Sixth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830002;3Xinjiang Institute of Materia Medica，Urumqi830004)

Abstract:Objective To investigate the mechanisms of action of transportation of compound YIZHIHAO extract (CYE)and compound YiZhiHao(CY)composite phospholipid liposomes(CPL)across Caco-2 cell monolayer model．M ethods The method of ammonium sulfate transmembrane gradients was adopted to prepare compound YiZhiHao composite phospholipid liposomes(CYCPL)，and Caco-2 cellwas applied to evaluate the transport properties of CYE and CYCPL．The concentration of CYE in Caco-2 cell experimentwas determined by HPLC．Results In Caco-2 cell uptake，a 6-fold increase on CYE permeability was obtained for CPLwhen compared with CYE alone，and P(app)of Apical to Basolateralwas equal to that of Basolateral to Apical，which indicated that the transport of CYE was passive diffusion．Due to CPL，the permeating amount of CYE was enhanced．Conclusion CPL could enhance transport of CYE and the permeating enhancementwas obviously improved on Caco-2 cellmonolayermodel．

Keywords:compound YiZhiHao;composite phospholipid liposomes;encapsulation efficiency;Caco-2 cellmodel

［收稿日期:2015-11-6］

通信作者:邢建国，男，教授，硕士生导师，研究方向:新药研究与开发，E-mail:xjguodd@163．com。

作者简介:陈蕾(1980－)，女，硕士，副主任药师，研究方向:中药新药研究。

基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金(2014211C136)。

doi:10．3969/j．issn．1009-5551．2016．03．014

中图分类号:R914

文献标识码:A

文章编号:1009-5551(2016)03-0320-05