HBV慢性感染者肝脏组织中CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs细胞的表达水平

程婷婷，王凤梅，朱争艳，刘辉，吕洪敏

（1.天津医科大学第三中心临床学院消化（肝病）科，天津300170；2.天津市第三中心医院消化（肝病）科，天津300170；3.天津市第三中心医院，天津市肝胆疾病研究所，天津市人工细胞重点实验室，天津300170）

论著

HBV慢性感染者肝脏组织中CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs细胞的表达水平

程婷婷1,2，王凤梅2，朱争艳3，刘辉3，吕洪敏2

（1.天津医科大学第三中心临床学院消化（肝病）科，天津300170；2.天津市第三中心医院消化（肝病）科，天津300170；3.天津市第三中心医院，天津市肝胆疾病研究所，天津市人工细胞重点实验室，天津300170）

目的：计数慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者肝脏组织中CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs细胞，观察不同免疫状态下的肝脏组织中CD4+T和CD8+T细胞表达水平之间的差异，探索其临床意义。方法:选取慢性HBV感染者68例，健康对照组（非HBV感染组）30例，运用免疫组织化学的方法进行检测。结果：慢性HBV感染组的CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs细胞表达水平明显升高，与非HBV感染组相比，P均＜0.001；在HBV感染组中，CD4+T和CD8+T细胞在免疫耐受期患者肝脏组织中的表达水平最低，CD4+T、CD8+T细胞在免疫清除期、再活动期中的表达水平与二者在免疫耐受期相比，均有增高趋势，然而CD4+T、CD8+T细胞的表达水平在免疫耐受期、免疫清除期、低复制期及再活动期任意两期之间比较，P均＞0.05。结论：CD4+T和CD8+T细胞在免疫耐受期、免疫清除期、低复制期及再活动期患者肝脏组织中表达水平的变化趋势在一定程度上反应了各期肝脏的免疫状态；FoxP3+Tregs细胞可能与HBV感染慢性化有关。

乙型肝炎病毒；CD4+T细胞；CD8+T细胞；FoxP3+Tregs细胞；肝脏

慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是临床常见的慢性肝病之一，其感染进程受病毒、宿主及外界环境等因素的影响，被划分为免疫耐受期、免疫清除期、低复制期以及再活动期4个时期[1]。机体的特异和非特异性免疫反应在防御外界病原体、维持机体免疫平衡的过程中发挥重要作用，尤其是特异性免疫反应，其作用的发挥亦贯穿了HBV感染的整个过程[2]，之前已有学者对HBV感染者外周血及肝脏组织中的CD4+T和CD8+T细胞进行了大量研究[3-5]，但关于二者在免疫耐受期、免疫清除期、低复制期以及再活动期患者肝脏组织中含量差异的研究尚少。CD4+Treg具有无反应和免疫抑制性两大功能，对多种T细胞具有调节功能，与慢性HBV感染的发生发展密切相关，FoxP3是调节性T细胞特异性的核转录因子，对其分化及功能的发挥具有重要作用。因此本研究主要观察慢性HBV感染者肝脏组织中CD8+T和CD4+T细胞及FoxP3+Tregs的表达水平，并进一步观察HBV感染者各期肝脏组织中CD8+T和CD4+T细胞的含量差异，探索其临床意义。

1 资料和方法

1.1 组织样本 98例共294个组织样本均取自天津市第三中心医院病理科，HBV感染组68例，男44例，女24例，平均年龄（44±12）岁，其中免疫耐受期13例，免疫清除期11例，低复制期37例，再活动期7例[分期依据：免疫耐受期：血清HBsAg和HBeAg阳性，HBV DNA＞107cs/mL，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）正常，肝组织无明显异常；免疫清除期：ALT升高，HBV DNA＞104cs/mL，肝组织有坏死、炎症或纤维化；低复制期：HBeAg阴性，抗-HBe阳性，HBV DNA＜104cs/mL，ALT正常，肝组织学无或有轻度炎症；再活动期：患者表现为HBeAg阴性，抗-HBe阳性，ALT升高，且HBV DNA由阴性转为阳性或者持续增高]。另选30例取自肝血管瘤周围的正常肝组织作为健康对照组（非HBV感染组），男5例，女25例，平均年龄（48±9）岁，对照组成员外周血肝功能完全正常，病毒标志全阴性。凡伴有其它病毒性肝炎或HIV感染、酒精性肝病、脂肪性肝病或自身免疫性肝病以及药物性肝损伤的肝病患者均排除在外。慢性HBV感染自然史分期参照慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）。该研究经天津市第三中心医院伦理委员会批准，每份样本的取得均获得患者的知情同意。

1.2 免疫组化步骤 福尔马林固定、石蜡包埋的肝脏组织以4 μm的厚度切片。所有组织切片在70℃的烤箱中加热50 min后均经脱蜡水化，高温高压下于pH 6.0的磷酸盐缓冲液或pH 8.0的EDTA中进行抗原修复，单克隆抗体FoxP3（236A/E7,ab20034，1∶100）、鼠抗人CD8抗体（144B，ab17147，1∶50）、鼠抗人CD4抗体（ZM-0418,即用型）和二抗PV-9000（北京中杉金桥生物技术有限公司）用于染色，DAB显色后，苏木素复染。树脂干燥后在显微镜下观察，照相。

1.3 结果判定 免疫组化结果判定由两名资深病理医师在不知道临床诊断的前提下独立阅片。图像采集用日本奥林巴斯BX51显微镜高倍镜像下（HPF,×400）随机选取5个视野，固定拍摄条件下统一进行拍摄图片。再使用IPP5.1软件编制宏，运用宏程序对拍摄图片中的CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs细胞进行批量计数，然后用标本中所取的5个视野的计数总和除以5，得到的平均数作为每个标本的CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs细胞的最终数目。

1.4 统计学处理 所有统计学分析均使用SPSS 20.0软件处理。正态分布的计量资料以均数±标准差表示；非正态分布的计量资料以中位数和四分位数间距Median（IQR）表示。两组间比较采用Kruskal-Wallis U检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。相关性分析采用Spearman检验。均为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD8+T、CD4+T、FoxP3+Tregs细胞在慢性HBV感染者肝脏组织中的表达情况 CD8+T、CD4+T、FoxP3+Tregs细胞在肝脏组织中的表达情况见图1。与非HBV感染组相比，慢性HBV感染组肝脏组织中CD8+T、CD4+T和FoxP3+Tregs细胞表达水平明显升高，且P均＜0.001，见表1。

图1 CD4+T、CD8+T和FoxP3+Tregs细胞在慢性HBV感染组和对照组中的表达情况(HPF，×400)Fig 1 Expressions of CD4+T,CD8+T and FoxP3+Tregs in the chronic HBV infection group and healthy control group（HPF，×400）

表1 两组肝脏组织中CD4+T、CD8+T、FoxP3+Tregs细胞表达水平Tab 1 LevelsofCD4+T,CD8+TandFoxP3+TregsinthechronicHBV infection group and non-HBV infection

2.2 处于HBV感染自然史不同阶段的肝脏组织中CD4+T和CD8+T细胞表达水平 HBV感染者肝脏组织中的CD4+T细胞在4期之间的表达水平由高到低依次为免疫清除期、再活动期、低复制期、免疫耐受期；然而CD4+T细胞在免疫耐受期、免疫清除期、低复制期及再活动期任意两期之间比较，其表达水平均无统计学差异。CD8+T细胞在4期之间的表达水平由高到低依次为免疫清除期、低复制期、再活动期、免疫耐受期；其表达水平在免疫耐受期、免疫清除期、低复制期及再活动期任意两期之间比较，P均＞0.05，见表2。

表2 不同HBV感染阶段的肝脏组织中CD4+T、CD8+T细胞表达水平比较Tab 2 LevelsofCD4+T，CD8+Tcellsinthelivertissueatthedifferent stages of chronic HBV infection

2.3 慢性HBV感染者肝脏组织中FoxP3+Tregs细胞与CD8+T细胞的关系 慢性HBV感染者肝脏组织中FoxP3+Tregs细胞表达水平随CD8+T细胞的上升而有所上升（r=0.397，P＜0.01），见图2。

图2 FoxP3+Tregs细胞与CD8+T细胞之间的关系Fig 2 Correlation between FoxP3+Tregs and CD8+T

3 讨论

T淋巴细胞亚群及其相关细胞因子，尤其是CD4+T和CD8+T细胞在慢性HBV感染的发生发展中发挥重要作用。CD4+T细胞是一类辅助性细胞，能够协助CD8+T细胞识别感染的肝细胞，通过细胞溶解或非溶机制抑制HBV的复制[6]，慢性HBV感染过程中，抗原的长期刺激会导致患者体内T淋巴细胞的慢性消耗，影响病毒的清除。然而本研究结果示，与非HBV感染组相比，HBV感染组的CD4+T和CD8+T细胞均有明显增加，但增加的CD8+T细胞并未有效地清除HBV病毒，原因可能是：HBV清除过程中真正起作用的是细胞毒性T细胞，即活化的CD8+T细胞[7]；慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎e抗原（HBeAg）的高表达诱导CD8+T细胞产生免疫耐受；同时CD4+T细胞分化的特异性T辅助细胞水平有所降低[5]。因此我们得知T淋巴细胞数量上的变化并不能完全反映其功能的改变。另外我们还发现HBV感染者肝脏组织中的FoxP3+Tregs细胞的表达水平会随CD8+T细胞的上升而相应上升，众所周知，FoxP3+Tregs细胞作为一类具有免疫抑制作用的T淋巴细胞亚群，能够抑制CD8+T等细胞的功能[8-9]，Furuichi等[10]的研究发现剔除外周血的CD25+Tregs细胞能够增强CD8+T细胞的反应强度，因此可以认为是FoxP3+Tregs细胞在一定程度上抑制了CD8+T细胞的功能，从而造成机体真正参加免疫反应的活性细胞不足，导致了感染的迁延，进一步提示其与HBV感染慢性化有关[11]。

慢性HBV感染史一般分为4个时期，处于免疫耐受期的患者其机体免疫反应不足以清除病毒；低复制期患者对病毒有一定的控制；免疫清除期和再活动期患者，其机体正处于识别、清除病毒的过程，是病毒与宿主免疫抗衡的结果，各期都有独特的病毒学、生物化学特点，对患者进行自然史分期，了解肝脏的免疫状态，有助于制定治疗方案及判断预后，而目前关于慢性HBV感染史不同阶段免疫状况的研究尚缺乏，且已有的研究大都局限于外周血，对肝脏组织免疫微环境的研究不足。因此笔者对此进行了相应探索。结果显示CD4+T和CD8+T细胞在免疫耐受期的表达水平最低，在机体清除病毒的免疫清除期和再活动期均有升高的趋势，且在免疫清除期的表达水平最高，一定程度上能够反应出各期患者免疫反应之间的差异，有助于临床上指导治疗，评判患者的免疫能力。然而与Sprengers等[12]的研究结果基本一致，CD4+T和CD8+T细胞在免疫耐受期、免疫清除期、低复制期和再活动期中的表达水平均无统计学差异。邢汉前等[13]对HBV感染者免疫耐受期、免疫清除期、低复制期的研究则发现，免疫耐受期患者肝内浸润的CD4+T和CD8+T淋巴细胞明显少于免疫活动期患者，造成该差异的原因可能是：试验入组成员的病情严重程度不同，临床生化学指标和病毒学指标之间存在差异；另一方面，当特异性的CD8+T和CD4+T细胞不足以清除病毒时，会征召非特异性的T淋巴细胞入肝[3]，这也会影响CD8+T和CD4+T细胞的含量。因此为更加明确CD4+T和CD8+T细胞在各期之间表达水平的差异尚需进行大样本多中心的研究，并且对每个HBV感染者在不同时期的肝脏组织样本，进行纵向观察分析，这对慢性HBV感染者的个体化治疗及判断临床预后与转归是至关重要的。

综上，CD4+T和CD8+T细胞在免疫耐受期、免疫清除期、低复制期及再活动期患者肝脏组织中表达水平的变化在一定程度上反映了各期肝脏的免疫状态，同时我们的研究进一步证实FoxP3+Tregs细胞可能与HBV感染慢性化有关。

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（2015-10-12收稿）

Level of CD4+T，CD8+T and FoxP3+Tregs in the liver tissues of patients with chronic HBV infection

CHENG Ting-ting1,2,WANG Feng-mei2,ZHU Zheng-yan3,LIU Hui3,Lü Hong-min2
（1.Department of Gastroenterology and Hepatology,The Third Central Clinical College，Tianjin Medical University,Tianjin 300170, China;2.Department of Gastroenterology and Hepatology,The Third Central Hospital of Tianjin,Tianjin 300170,China;3.The Third Central Hospital of Tianjin,Key Laboratory of Artificial Cell,Institute of Hepatobiliary Disease,Tianjin 300170,China）

Objective：To count the number of CD4+T,CD8+T and FoxP3+Tregs in the liver tissue of patients with chronic HBV infection and compare the expression levels of CD4+T and CD8+T cells in liver tissues in different immune status.Methods：The levels of CD4+T, CD8+T and FoxP3+Tregs were detected by the method of immunohistochemistry in 68 chronic HBV infection patients,and 30 individuals without HBV infection as healthy control.Results：Compared with the non-HBV infection group,the expression level of CD4+T,CD8+T and FoxP3+Tregsweresignificantlyhigherin the chronic HBV infection group(P＜0.001);In chronic HBV infection group,the numbers of CD4+T and CD8+T in immune clearance and active period were higher than the ones in the immune tolerance,and the liver tissue from immune tolerance patients had lowest CD4+T and CD8+T levels,but P＞0.05 respectively.Conclusion：To some extent,the expression levels of CD4+T and CD8+T cells in the immune tolerance,immune clearance phase,low copy phase and active period indicate the liver immune status;and maybe FoxP3+Tregs are associated with chronic HBV infection.

hepatitis B virus CD4+T cells;CD8+T cells;FoxP3+T cells;liver

R512.6+2

A

1006－8147（2016）02-0129-04

天津市应用基础与前沿技术研究计划项目基金资助(13JCYBJC22500)，天津市卫生局科技基金(2010KZ123)

程婷婷(1987-)，女，硕士在读，研究方向：肝脏相关疾病；通信作者:吕洪敏，E-mail:lvhongmin58@163.com。