阿霉素肾病大鼠血清IL-17、IL-6的动态变化及其意义

张文晓，张碧丽

（1．天津医科大学研究生院，天津300070；2．天津市儿童医院肾脏科，天津300134）

论著

阿霉素肾病大鼠血清IL-17、IL-6的动态变化及其意义

张文晓1，张碧丽2

（1．天津医科大学研究生院，天津300070；2．天津市儿童医院肾脏科，天津300134）

目的：探究阿霉素肾病大鼠血清白细胞介素（IL）-17、IL-6的动态变化意义及泼尼松通过2种因子对阿霉素肾病的干预机制。方法：将81只大鼠随机分为空白对照组、模型组、泼尼松干预组，每组27只，通过分次尾静脉注射法建立阿霉素肾病大鼠模型，检测4、6、8周末大鼠血生化、24 h尿蛋白定量及尿肌酐变化，计算内生肌酐清除率；应用ELISA检测大鼠血清IL-17、IL-6水平的变化。结果：实验第4周末，与空白对照组比较，模型组和泼尼松干预组大鼠出现大量蛋白尿、低白蛋白血症和高脂血症（P＜0．05），提示模型建立成功；模型组和泼尼松干预组大鼠血清IL-17、IL-6水平高于空白对照组。实验第6、8周末，与模型组比较，泼尼松干预组24 h尿蛋白定量、血肌酐、总胆固醇显著降低（P＜0．05），血清总蛋白、白蛋白、内生肌酐清除率显著升高（P＜0．05）；泼尼松干预组大鼠血清IL-17、IL-6水平明显低于模型组（P＜0．05）。结论：IL-17、IL-6参与了阿霉素肾病的免疫发病机制，泼尼松可能通过降低血清IL-17、IL-6水平参与阿霉素肾病的治疗过程。

阿霉素肾病；肾病综合征；Th17细胞；IL-17；IL-6；大鼠

肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）是一组以大量蛋白尿、低白蛋白血症和高脂血症为主要表现的临床综合征，目前已成为儿童最常见的肾脏疾病之一，但其发病机制至今尚未充分阐明。近几十年，CD4+T细胞分泌紊乱在NS的免疫发病机制中的意义一直是学者们研究的重点，按产生的细胞因子不同，其亚群可分为Th1、Th2、Th17和调节性T细胞4种。既往实验对NS发病机制的研究主要集中于Th1/Th2细胞失衡理论，然而其具体失衡方向却一直颇受争议[1-2]。自2005年Th17细胞作为一种独立的Th细胞亚群提出[3]，大量学者将NS免疫发病机制的研究重点转向Th17细胞及其相关细胞因子的分泌紊乱。IL-17是Th17细胞分泌的主要细胞因子，其血清水平主要受Th17细胞的影响，可以有效提示生物体内Th17细胞的分化情况。IL-6在Th17细胞的分化产生过程中发挥着重要作用，通过诱导某些特定因子的表达，促进初始CD4+T细胞向Th17细胞分化[4]。本实验通过观察阿霉素肾病大鼠血清IL-17、IL-6水平的动态变化及二者经泼尼松治疗前后的改变，探讨阿霉素肾病的免疫发病机制及泼尼松对其可能的干预机制。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 注射用盐酸多柔比星（阿霉素）10 mg/只，批号：130710，浙江海正药业股份有限公司。醋酸泼尼松片5 mg/片，批号：130820，天津力生制药股份有限公司。大鼠IL-17、IL-6 ELISA试剂盒，批号LOT201505，美国R＆D公司。金属代谢笼由天津实验动物中心提供。

1.1.2 实验动物 健康雄性Wistar大鼠81只，体质量180～200 g，鼠龄（40±5）d，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，许可证编号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 方法

1.2.1 实验分组与模型制造 81只大鼠适应性喂养7 d，将全部大鼠随机分为空白对照组（A组）、模型组（B组）、泼尼松干预组（C组），每组27只。除A组外，其余两组大鼠采用小剂量间隔1周2次尾静脉注射阿霉素法造模，第1次注射0.1%阿霉素4 mg/kg，第2次注射3.5 mg/kg。A组大鼠尾静脉注射同等剂量的生理盐水。实验第4周末，检测各组大鼠血生化指标及24 h尿蛋白定量、尿肌酐，B、C组大鼠出现大量蛋白尿、低白蛋白血症、高脂血症，提示造模成功。实验第5周开始每日晨起给予C组大鼠泼尼松水溶液灌胃1次，剂量为12.5 mg/（kg·d）[药物等效剂量换算公式：大鼠剂量=折算系数（6.25）×人的剂量〈2 mg/(kg·d）〉]；A、B组大鼠予等剂量生理盐水灌胃1次。给药期间各组大鼠均自由摄取基础饲料及进水。

1.2.2 观测指标与检验方法 观察大鼠一般情况：按时记录大鼠体质量动态变化，观察大鼠精神状态、毛发色泽、活动及水肿情况。

实验第4、6、8周末，将全部大鼠置于代谢笼禁食不禁水，收集24 h尿液，记录24 h总尿量，检测24 h尿蛋白定量、尿肌酐；每次留尿后每组随机抽取9只处死，取血检测血生化，包括血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、血清总蛋白（Tp）、血清白蛋白（Alb）、血清球蛋白（Glo）、血清总胆固醇（TCho），计算内生肌酐清除率（Ccr）[mL/(min·kg）]=[尿肌酐浓度（μmol/L）×每分钟尿量（mL/min）]/[Scr浓度（μmol/L）×体质量（kg）]。

另留4、6、8周末处死大鼠血分离血清冻存，待实验结束，用ELISA试剂盒分别检测血清中IL-17、IL-6水平。具体步骤：准备试剂、样品和标准品；加入准备好的样品和标准品，37℃反应30 min；洗板5次，加入酶标试剂，37℃反应30 min；洗板5次，加入显色液A、B，37℃反应10min；加入终止液，15min内读OD值，根据OD值在标准曲线上查其浓度值。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计学分析。本研究数据属于正态分布资料，实验结果以s表示，多组间比较采用单因素方差分析；两组间比较，方差齐者采用LSD法，方差不齐者采用Dunnett T3法。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 大鼠一般情况观察 A组大鼠一般状况好，体质量增加（10±5）mg/d，色毛光泽，活动自如，未见水肿。B、C组大鼠在第2次阿霉素注射后开始出现进食减少，体质量减轻，至4周末可见色毛粗糙蓬松，触之反应激烈，阴囊出现水肿；B组大鼠4周后，一般状况持续较差，体质量未见上升，至6~8周出现四肢水肿，活动迟缓，还有多只出现腹水。C组大鼠4周后随药物干预治疗，一般状况逐渐改善，进食增多，体质量上升，阴囊水肿减轻，少见四肢水肿，无腹水出现。

2.2 各组大鼠血、尿生化指标检测结果 见表1。

2.2.1 实验第4周末血、尿生化指标检测结果 实验第4周末，B、C组大鼠24 h尿蛋白定量、SCr、TCho均明显高于A组（P＜0.05），Tp、Alb、Ccr均明显低于A组（P＜0.05），提示模型建立成功。

2.2.2 实验第6周末血、尿生化指标检测结果 实验第6周末，C组大鼠24 h蛋白尿定量、SCr、TCho明显低于B组（P＜0.05）,Tp、Alb、Ccr明显高于B组（P＜0.05）；与4周末比较，B组大鼠24h蛋白尿定量、SCr、TCho升高（P＜0.05），C组降低（P＜0.05），B组大鼠Tp、Alb、Ccr降低（P＜0.05），C组升高（P＜0.05）。

2.2.3 实验第8周末血、尿生化指标检测结果 实验第8周末，C组大鼠24 h蛋白尿定量、SCr、TCho显著低于B组（P＜0.05）,Tp、Alb、Ccr显著高于B组（P＜0.05）；与6周末比较，B组大鼠24 h蛋白尿定量、SCr、TCho进一步升高（P＜0.05），C组明显降低（P＜0.05），B组大鼠Tp、Alb、Ccr进一步降低（P＜0.05），C组明显升高（P＜0.05）。

2.3 各组大鼠血清IL-17、IL-6水平 实验第4周末，B、C组大鼠与A组比较，血清IL-17、IL-6水平显著升高（P＜0.05）。实验第6周末，C组大鼠血清IL-17、IL-6水平低于B组（P＜0.05）；与4周末比较，B组大鼠血清IL-17、IL-6水平升高（P＜0.05），C组降低（P＜0．05）。实验第8周末，C组大鼠血清IL-17、IL-6水平低于B组（P＜0．05）；与6周末比较，B组大鼠血清IL-17、IL-6水平进一步升高（P＜0．05），C组降低（P＜0．05）。见表2。

表1 A组、B组、C组血、尿生化指标的动态变化（s）Tab 1 Blood and urine biochemical indexes of group A,group B and group C（s）

表1 A组、B组、C组血、尿生化指标的动态变化（s）Tab 1 Blood and urine biochemical indexes of group A,group B and group C（s）

与A组相比，aP＜0.05；与B组相比，bP＜0.05；dP＜0.05；与4周相比；eP＜0.05；与6周相比，fP＜0.05

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表2 A组、B组、C组血清IL-17、IL-6水平（s）Tab 2 Serum IL-17,IL-6 levels of group A,group B and group C（s）

表2 A组、B组、C组血清IL-17、IL-6水平（s）Tab 2 Serum IL-17,IL-6 levels of group A,group B and group C（s）

与A组相比，aP＜0.05；与B组相比，bP＜0.05，dP＜0.05；与4周相比，eP＜0.05；与6周相比，fP＜0.05

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3 讨论

阿霉素肾病大鼠模型的主要表现及病理变化类似于人类NS，尤其是儿童最常见的微小病变型肾病（MCNS），目前已被国内外学者广泛用于儿童NS的研究。本实验采用2次尾静脉注射法建立肾病模型，于实验4周末出现大量蛋白尿、低白蛋白血症、高脂血症，提示模型建立成功。

大量研究证明，NS患儿体内存在细胞免疫失衡及细胞因子的分泌紊乱[5-6]。Th17细胞是一种重要的促炎细胞，在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要的意义。Hünemörder等[7]在2015年研究发现，在一些肾小球疾病中，肾组织Th17细胞表达增加，提示Th17细胞分化异常在肾脏疾病中发挥一定作用。IL-17是由Th17细胞分泌的特征性细胞因子，与Th17细胞的生物学效应关系最为密切，具有强烈的促炎作用可引起炎症组织细胞浸润和组织破坏[8]。此外也有研究证明，血清IL-17的异常分泌在多种自身免疫性疾病中扮演着重要角色[9-10]。Th17细胞的分化发育及分泌效应因子需要TGF-β、IL-6、IL-23等多种细胞因子共同参与，IL-6在此过程中发挥首要作用。IL-6在生物体内主要由活化的T细胞、成纤维细胞及一些抗原呈递细胞分泌，是一种多效性前炎症细胞因子，可与多种细胞因子共同作用于各种靶细胞，在许多炎症性疾病中高表达。

IL-17和IL-6两种细胞因子不仅在Th17细胞的分化过程中各自发挥作用，二者还存在一定关联。IL-6可以通过诱导Th17细胞胞内特征性表达的转录因子孤独受体γt(orphan nuclear receptor gamma t，RORγt)，促进CD4+细胞向Th17细胞的分化阶段[11]，继而分泌大量IL-17。IL-17又可以通过NF-κβ信号通路引发IL-6产生的正反馈环，促进IL-6的产生及相关炎症反应。所以IL-6既是Th17细胞的上游调控因子，又是IL-17下游一个重要靶目标，二者相互影响与Th17细胞介导的免疫应答密切相关。在肾组织中，IL-17和IL-6的异常分泌均可参与肾小球的损害，促发蛋白尿的产生，从而加速NS的进展。IL-17能够促进上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞等分泌大量趋化因子和细胞因子，这些因子可以集体动员、募集及活化中性粒细胞，促进大量炎症细胞在肾组织聚集，破坏肾组织结构，导致肾小球滤过膜通透性增加，从而出现蛋白尿，肾功能不全等继发改变。Wang等[12]在2013年研究发现在NS患儿外周血Th17细胞频率和肾组织IL-17水平升高，推测Th17/IL-17及其相关因子对NS儿童肾组织产生一定的破坏，并参与蛋白尿的产生过程。IL-6在肾组织中由肾小球固有细胞如系膜细胞、内皮细胞、上皮细胞等分泌，其可通过自分泌和旁分泌的方式刺激系膜细胞增殖；同时，IL-6又可与其他细胞因子相互作用启动或促进肾组织的炎症和损伤，影响蛋白尿的产生发展以及肾脏病理改变，从而导致肾功能的降低[13]。2010年Wang等[14]研究发现在阿霉素肾病大鼠尿液和肾组织中IL-6水平均明显升高，并且与24 h尿蛋白定量呈正相关，推测IL-6在MCNS的发病中起到一定的作用，但有关直接证据及具体机制尚需进一步研究。

在本研究中，实验第4周末阿霉素肾病模型建立成功后，模型组及泼尼松干预组大鼠血清IL-17、IL-6水平明显高于空白对照组，提示阿霉素肾病大鼠体内Th17细胞分化活跃，导致其主要细胞因子IL-17分泌增多，同时可以推测，Th17细胞及IL-17增多可能与其相关的前炎症因子IL-6的过度释放有关。另一方面，IL-17过度释放也有可能进一步作用于其下游因子IL-6，激活其正反馈环，使其过度释放。大量IL-17、IL-6可促进多种炎症介质向肾脏募集，并与之共同作用于肾组织破坏其正常病理结构。在实验第6、8周末，模型组大鼠24 h尿蛋白定量、SCr水平持续上升，说明大鼠阿霉素肾病较人体MCNS发展迅速，这与之前大量实验的结果一致[15-16]，可能与大鼠和人类的异质性有关。同时，模型组大鼠血清IL-17、IL-6呈进行性升高，进一步说明IL-17、IL-6两种因子参与了大鼠阿霉素肾病的发生、发展，阿霉素肾病大鼠体内有可能存在Th17细胞的过度分化，两种因子的血清水平可以在一定程度上反映肾脏损害的程度。

另外，实验第6、8周末，泼尼松干预组大鼠蛋白尿水平持续降低，且明显低于模型组，提示大鼠经泼尼松治疗病情有所好转，泼尼松对阿霉素肾病起到一定治疗作用。同时，其血清IL-17、IL-6水平持续下降，说明泼尼松可以下调阿霉素肾病大鼠血清IL-17、IL-6水平，抑制Th17细胞的过度分化。据此推测，泼尼松对阿霉素肾病的治疗作用可能与其对两种因子的调节及对Th17细胞的抑制有关。

综上所述，该实验证明阿霉素肾病大鼠体内存在IL-17、IL-6的分泌增加，也进一步证实Th17细胞的过度分化参与了阿霉素肾病的免疫发病过程。结合大鼠治疗前后血清IL-17、IL-6水平及血、尿生化值改变，推测泼尼松对肾脏的保护作用可能与其对血清IL-17、IL-6水平的调节作用有关。临床上还有待大量实验来探究，控制血清IL-17、IL-6水平及纠正Th17细胞过度分化的干预手段是否可以对NS起到一定的治疗作用，延缓NS的进程。

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（2015-11-20收稿）

Dynamic changes and significance of serum IL-17 and IL-6 in adriamycin-induced nephropathy rats

ZHANG Wen-xiao1，ZHANG Bi-li2
（1．Graduate School,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2．Department of Nephrology，Tianjin Children’s Hospital，Tianjin 300134，China）

Objective：To explore the significance of dynamic change of serum interleukin(IL)-17,IL-6 in adriamycin(ADR)-induced nephropathy rats and the mechanism of prednisone intervention in ADR-induced nephropathy．Methods：Eighty-one rats were randomly divided into control group,model group,and prednisone intervention group．ADR model was induced by a tail intravenous injection of ADR twice．The blood biochemical indexes and 24 h urinary protein,urine creatinine were measured at the end of 4,6 and 8 weeks．The values of creatinine clearance(Ccr)were calculated by the formula．The expressions of serum IL-17 and IL-6 were detected by ELISA．Results：heavy proteinuria,hypoalbuminemia,hyperlipemia were measured in other groups at the end of 4 weeks compared with control group,indicating that the models were successfully established．The levels of IL-17 and IL-6 in model group and prednisone intervention group were higher than control group at the end of 4 weeks(P＜0．05)．At the end of 6 and 8 weeks,compared with model group,24 h proteinuria,urine creatinine,total cholesterol,serum creatinine,blood urea nitrogen in prednisone intervention group were decreased significantly(P＜0．05),while serum total protein,albumin,endogenous creatinine clearance rate were increased significantly(P＜0．05)．The expressions of serum IL-17 and IL-6 in prednisone intervention group were lower than control group(P＜0．05)．Conclusion：IL-17 and IL-6 may be involved in the immune pathogenesis of ADR-induced nephropathy rats．Prednisone could treat ADR-induced nephropathy by reducing the serum levels of IL-17 and IL-6．

adriamycin-induced nephrosis；nephrotic syndrome；Th17 cells；IL-17；IL-6;rat

R692

A

1006－8147（2016）03-0204-04

天津市应用基础与前沿技术研究计划项目基金资助（13JCYBJC22300）

张文晓（1990-），女，硕士在读，研究方向：儿科学；通信作者：张碧丽，E-mail：zhangbili218@163.com。