金龟子绿僵菌胞外蛋白酶活性与毒力的相关性

李保国　张丹丹　李瑞军　刘廷辉

摘要：为研究金龟子绿僵菌蛋白酶活性与毒力的关系，以黄粉虫为试虫测定金龟子绿僵菌的毒力，采用Folin-酚试剂法对其胞外蛋白酶活性进行测定，并分析蛋白酶活性与毒力的关系。结果表明，不同菌株的蛋白酶活性差异较大，酶活性与毒力存在一定线性关系。胞外蛋白酶的活性可作为金龟子绿僵菌毒力判定的指标之一。

关键词：金龟子绿僵菌；胞外蛋白酶；Folin-酚试剂法；黄粉虫；毒力测定

中图分类号：S433.5 文献标志码：A 文章编号：1002—1302（2016）01—0166—02

金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是一种广泛存在的昆虫寄生真菌，其寄主有200多種，且致病力强、持效期长、不易产生抗药性、对人畜无害，利用其开发微生物杀虫剂具有良好发展前景。金龟子绿僵菌需要酶分解寄主昆虫的表皮，以进入昆虫体内完成侵染过程。关于杀虫真菌胞外酶的研究较多，Kucera等在昆虫体壁离体培养条件下首次发现蛋白酶的活性，并指出菌株的蛋白酶活力与其毒力存在关系。Michael等利用明胶作为唯一碳源、氮源，发现球孢白僵菌可在平板上分泌一种蛋白酶，众多学者利用这一方法测定胞外蛋白酶含量。樊美珍等利用该方法，以马尾松毛虫作为试虫，测定球孢白僵菌胞外蛋白酶的产量与毒力的关系，证实了其具有相关性。王刚对已有研究进行了系统性总结，发现球孢白僵菌的蛋白酶可作为参考毒力指标，虽具有一定可靠性，但不能夸大其作用，应谨慎使用。冯光明对不同来源的17株球孢白僵菌进行研究发现，蛋白酶活性可作为菌株毒力判定的标准之一，但不能夸大其作用。可见，胞外蛋白酶与其毒力判定存在一定关系，但由于所用试虫不同，测定胞外酶的方法也不同，因此结论具有一定差异。

在蛋白質的测定方面，Folin-酚试剂法比双缩脲法灵敏100倍、比茚三酮方法灵敏数倍，且操作简单易行，是研究蛋白质较为精准的检测方法。黄粉虫（Tenebrio molitor L.）诱集法是一种经济、简单的土壤昆虫病原真菌分离方法。本试验利用Folin-酚试剂法测定金龟子绿僵菌的胞外蛋白酶活性，利用黄粉虫幼虫作为标准试虫进行毒力测定，探讨金龟子绿僵菌胞外蛋白酶活性与毒力的关系，以期建立标准方法，避免因酶测定方法和试虫的不同影响研究结论。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株及试虫 供试菌株为金龟子绿僵菌菌株，由北方野外土壤中诱集分离得到并保存。试虫为黄粉虫（Tenebrio molitor L.），由笔者所在实验室饲养，挑选低龄幼虫进行毒力测定。

1.1.2药品 吐温、PDA培养基、SDA培养基、酪氨酸、酪蛋白，Folin-酚试剂为生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.2方法

1.2.1孢子悬浮液的配制 配制体积分数为1×10⁸个/mL的孢子悬浮液：将接种于PDA培养基的金龟子绿僵菌在（25±1）℃下恒温培养10 d，刮取孢子置于研磨器中充分研磨，加入0.05%吐温-80无菌水，倒人已灭菌烧杯中，涡旋振荡使其充分混匀。采用血球计数板计数，调整至指定体积分数。

1.2.2粗酶液的制备 将各菌株1×10⁸个/mL的孢子悬浮液按1%的量分别接人液体SDA培养基（100 mL液体SDA培养基于250 mL三角瓶中），以加入0.05%吐温-80无菌水的样品为对照，于25℃、150 r/min在旋转式摇床中培养，按时取培养物并用滤纸过滤，利用滤液测定蛋白酶活性。

1.2.3粗酶液蛋白酶含量的测定 以酪蛋白为底物，利用Tris-HCl缓冲液（0.05 mol/L，pH值8.5）配成10g/L的酪蛋白溶液。取该溶液1 mL并添加待测酶液1 mL，于37℃反应30 min，每个处理3次重复。采用2 mL 0.4 mol/L的三氯乙酸终止反应。过滤后采用Folin-酚试剂进行检测，每管加入400μL样品溶液、2 mL FolinAB混合液（按1：50的比例配制），室温下静置10 min后，加入200μL酚试剂并静置30 min，在650 nm波长下测定吸光值。以每分钟催化分解生成1μg酪氨酸的酶量为1个活性单位（U/mL），用酪氨酸标准溶液制作标准曲线，从而得到不同菌株的胞外蛋白酶活性。

1.2.4培养时间对金龟子绿僵菌胞外蛋白酶活性的影响 选取金龟子绿僵菌菌株M11-8-7和M7-5-7，按上述方法培养7 d，每天测定其胞外蛋白酶活性并记录。

1.2.5不同菌株胞外蛋白酶活性的测定 选取6株金龟子绿僵菌，按上述方法培养5 d，测定其胞外蛋白酶活性并记录。

1.2.6金龟子绿僵菌对黄粉虫幼虫致病力的初步测定 将接种于PDA培养基的金龟子绿僵菌菌种置于（25±1）℃恒温培养10 d，刮取孢子置于研磨器中充分研磨，采用0.05%吐温-80无菌水配制成体积分数为1×10⁸个/mL的孢子悬浮液。用纱布包裹黄粉虫幼虫，在菌液中浸泡3 s后取出，对照组采用等量0.05%吐温-80无菌水。每组设3个重复，每个重复10头试虫。在饲养条件下连续观察10 d，每天记录试虫的死亡数，并采用DPS软件进行数据统计分析。

2结果与分析

2.1酪氨酸标准曲线

通过酪氨酸标准溶液绘制标准曲线（图1），y为吸光度D_650nm，x为蛋白酶活性，以每分钟催化分解生成μg酪氨酸的酶量为1个活性单位（U/mL）。标准曲线的线性方程为y=0.011 3x+0.083 6，r²=0.983 5。

2.2培养时间对胞外蛋白酶活性的影响

连续7 d测定金龟子绿僵菌M11-8-7、M7-5-7菌株的蛋白酶活性（图2）。胞外蛋白酶活性在前几天呈增长趋势，于5 d达到最大值，之后有所下降；因此，测定酶活性与毒力的关系时，选用培养5 d的培养物。

2.3 6株金龟子绿僵菌的蛋白酶活性和毒力

由酪氨酸标准曲线可得到6种菌株的蛋白酶活性，对其进行相关性分析。相关性分析结果（表1）表明，不同菌株产生的蛋白酶活性具有显著差异。以黄粉虫作为试虫进行毒力测定，利用DPS软件分析数据。由表2可知，金龟子绿僵菌M7-5-7、M8-5-83、M8-6-291菌株的蛋白酶活性较弱，毒力较差；M7-10菌株的蛋白酶活性强，毒力也相对较强。对表2数据进行相关性分析表明，金龟子绿僵菌的蛋白酶活性y₁与致死中时的自然对数x₁存在线性函数关系：y=47.79-12.19x，r²=0.8978。可见，金龟子绿僵菌的蛋白酶活性与毒力存在较强的线性相关性，可将蛋白酶活性作为判断菌株毒力强弱的指标。

3結论与讨论

金龟子绿僵菌的侵染过程须破坏昆虫表皮，蛋白酶是破坏昆虫体壁的重要物质之一。昆虫表皮成分中含60%～80%蛋白质，杀虫真菌对蛋白质的分解成为其侵染昆虫的重要条件之一，因此蛋白酶的活性强弱是判定杀虫真菌侵染昆虫能力的重要指标。Folin-酚试剂检测酪氨酸比明胶-琼脂平板法、双缩脲法、紫外分光光度法等其他检测方法更加精确可靠，为检测杀虫真菌分泌的蛋白酶活性提供了良好平台。黄粉虫是常用于诱集土壤金龟子绿僵菌的昆虫，具有一定代表性，以黄粉虫作为试虫可更好地研究金龟子绿僵菌胞外蛋白酶活性与毒力的关系。

金龟子绿僵菌分泌胞外蛋白酶具有明显的时间动态，研究结果显示，培养5 d时2株菌的胞外蛋白酶活性最高，之后有所下降，这可能与培养基的营养含量有关。根据该结果选择在培养5 d时进行检测，以准确揭示菌株的胞外蛋白酶活性。然而，不同条件下、不同菌株分泌胞外蛋白酶的时间动态特性尚有待进一步研究。

蛋白酶活性与金龟子绿僵菌的侵染能力具有一定线性关系，若金龟子绿僵菌所产的胞外蛋白酶活性强，其毒力也相对较强；若胞外蛋白酶活性弱，其毒力也相对较弱。胞外蛋白酶活性不仅可作为球孢白僵菌毒力强弱的评价因子，还可作为金龟子绿僵菌毒力评判的重要指标。由试验结果y=47.79-12.19x，r²=0.897 8可知，胞外蛋白酶活性與毒力的正相关性不高，表明影响毒力的因素很多，包括侵入过程中几丁质酶、脂酶等其他酶的作用，以及侵入后更为复杂的毒理过程；因此，以酶的活性作为毒力指标时应持谨慎态度。刘智辉等认为胞外酶的活性应在一定条件下使用，或作为大量菌株初筛工作的参考指标。

本研究方法是对此方面研究的一次尝试，试验方法不同、相同菌株对不同试虫毒力的差异均会影响试验结论。本研究采用Folin-酚试剂法，以黄粉虫作为标准试虫，统一金龟子绿僵菌胞外蛋白酶活性与毒力相关性的研究方法，避免因试验方法、试虫的不同而产生不同结论。