金属离子对产油微生物油脂积累影响的研究进展

李涛，纪晓俊，吴娜，宗嘉骏，黄和，俞亚东（南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京211816）



金属离子对产油微生物油脂积累影响的研究进展

李涛，纪晓俊，吴娜，宗嘉骏，黄和，俞亚东
（南京工业大学生物与制药工程学院，材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京211816）

摘要：利用产油微生物合成含量丰富的油脂，对于解决石化能源日益紧缺问题，改善人类生活水平具有重要意义。金属离子能影响产油微生物生长形态、细胞内外渗透压和油脂合成关键酶活力等，对产油微生物油脂合成有重要的调控作用。本文首先介绍了产油微生物的产油机制，随后重点阐述了金属离子对产油微生物油脂积累的影响及其分子机理，最后对进一步探讨金属离子在产油微生物发酵过程中的作用研究提出一些建议。文章指出由于产油微生物油脂合成途径不尽相同，在工业上利用产油微生物生产油脂时，应从该微生物油脂合成的主要途径入手，找出该途径中的关键酶，随后充分考虑不同微生物对金属离子的耐受性、不同金属离子对微生物形态和胞内关键酶活力的影响，以及不同金属离子之间对同种关键酶的活性中心是否存在竞争或协同的关系等，从而制定可行的金属离子添加控制策略。

关键词：金属离子；酶；产油微生物；代谢；发酵；多不饱和脂肪酸；油脂

第一作者：李涛（1991—），男，硕士研究生。联系人：俞亚东，助理研究员，研究方向为产油微生物生理特性研究。E-mail yadongyu@ njtech.edu.cn。

随着石油等资源紧缺问题日益突出，多渠道开发可再生油脂资源已成为大势所趋。微生物油脂具有油脂含量高、碳源利用广、生产周期短等特点，工业化开发潜力巨大。此外，产油微生物还能合成对人体生长和健康十分有益的功能性油脂，如花生四烯酸（arachidonic acid）、γ-亚麻酸（linolenic acid）、二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid）、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid）等。因而开发利用产油微生物合成油脂，具有重要的社会和经济价值。

在适宜条件下，某些微生物能合成并储存的油脂占其生物总量的20％以上，具有该特征的菌株称为产油微生物[1-2]。已知细菌、酵母、霉菌、藻类中都有能产生油脂的菌株，但以酵母菌和霉菌为主。微生物油脂合成过程中，碳源和氮源是影响微生物代谢的两种重要因素。事实上，除了碳源和氮源外，还有多种其他外界因素能影响产油微生物，其中即包含各种金属离子。研究者早已发现，添加一定量的金属离子对于产油微生物完成正常代谢活动和合成油脂是必要的[3]。然而金属离子超过一定浓度后，即对产油微生物产生不利影响[4-5]。不幸的是，工业化生产中的一些金属离子在发酵培养基中往往是超量的。这主要是由于：①工业生产中，很多发酵装置都不可避免地由金属制成，当这些金属发酵装置腐蚀时，金属离子势必会进入到发酵液中；②发酵用水、发酵原料中也可能会含有一些金属离子。特别是近年来为了应对环境污染问题和降低发酵成本，许多企业采用一些金属离子含量高的工业废水、废弃物作为生产原料[6]。这些超量的金属离子严重影响了产油微生物的正常代谢过程，造成油脂合成量显著下降，限制了微生物油脂的开发和利用。

为解决上述问题，一方面需要改进生产工艺，减少因设备腐蚀等原因造成的金属离子含量升高；另一方面急需了解金属离子影响产油微生物代谢的分子机制，从而有望改造现有产油微生物，以提高其对金属离子的耐受性。鉴于此，本文对产油微生物油脂合成积累的机制以及金属离子影响产油微生物研究作一综述，以期帮助产油微生物油脂的工业化生产。

1　微生物产油机理简介

经过几十年的研究，目前人类已经对产油微生物油脂合成的机制有了较多的认识。在大多数产油微生物中，油脂合成分为4个阶段：乙酰-CoA的形成、脂肪酸的合成、脂肪酸碳链的延长和去饱和、甘油三酯合成。在油脂合成最初阶段，线粒体内会通过柠檬酸循环（TCA）合成柠檬酸，积累的柠檬酸会通过线粒体膜上的苹果酸/柠檬酸转移酶转运进入细胞质中，然后再在ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-Citrate lyase）的作用下裂解生成乙酰-CoA和草酸乙酸。乙酰-CoA在乙酰-CoA羧化酶催化下转化为丙二酰单酰-CoA。之后，由脂肪酸合酶复合体的催化下，经过合成、还原、脱水、再还原反应实现链的延长，直到达到微生物普遍具有的脂肪酸长度（一般在C16～C18）见图1[7-8]。在产油微生物中更长链的脂肪酸或不饱和脂肪酸等大都以软脂酸为前体，经过碳链延长（增加两个碳原子）和脱饱和（引入一个双键）两个主要反应最终形成ω-3和ω-6系列的长链饱和与不饱和脂肪酸见图1[9-12]（以产油酵母为例）。合成的脂肪酸长链大多会以甘油脂或磷脂的形式存储。

在整个脂肪酸的合成代谢过程中涉及到多种酶的调节，这些酶大多数是可以结合金属离子的金属蛋白酶，为了使碳源更多的流向油脂合成方向，微生物油脂合成中需要不同酶的协同作用[13]。

2　金属离子对产油微生物的影响

对微生物生长影响较大的几种是钠、钾、钙、镁、铁、锰、锌、铜等金属离子。研究发现，这些金属离子能够对产油微生物的微生物形态和生长、胞内外渗透压和酶活力产生作用，从而影响产油微生物的油脂合成能力。以下将从微生物形态和生长、渗透压和酶活力3个方面阐述金属离子对产油微生物的影响机制。

2.1金属离子对产油微生物形态和生长的影响

在产油真菌发酵方面，菌丝体形态可以影响到细胞氧气传质、营养物传递和发酵液黏度等。因此，微生物形态的好坏对产油的高低起着至关重要的作用。例如，在高山被孢霉发酵产花生四烯酸中，培养基成分能很大程度上影响菌丝体形态，进而改变产物产率。其中镁离子、钙离子等金属离子的添加，对于高山被孢霉的最佳菌丝体形态的形成尤为重要[14]。当镁离子、钙离子少量添加时，会使菌丝体成球状，增加了氧的传质，同时避免了剪切力增加对菌丝体的伤害。但当添加比例过高时，会使菌丝体形态成糊状，不利于氧传递[14]。BRAUN等[15]也证实钙离子能导致菌丝聚集和菌球形成，推测可能是钙离子能改变了孢子和菌丝的表面电荷。HIGASHIYAMA等[16]在发酵高山被孢霉（Mortierella alpina）中添加钙离子、镁离子发现金属离子可以改变菌丝体形态促进菌体成球，影响氧的传递效率进而影响油脂产量。虽然目前已发现金属离子对产油微生物菌丝体的形态有显著影响，但其影响机理尚未完全探明，更没有建立恰当的形态学参数来指导金属离子的添加。

图1　产油酵母油脂合成的一般途径

2.2金属离子渗透压对产油微生物油脂积累的影响

产油微生物种类繁多，挖掘自不同的生长环境，有些微生物对渗透压有着特殊的要求。例如，从海水中筛选出来的产油菌株对渗透压的要求很高，恰恰是一些金属离子（Na+、K+）可以改变渗透压以适应菌株生长需要。另一方面，随着工业利用金属离子含量高的废水、废弃物发酵，使得工业生产中，许多产油微生物培养基中盐度大大增加，渗透压的这一变化严重影响了微生物生长。因此，在金属离子对产油微生物酶活影响之外，还存在着金属离子浓度通过产生的不同渗透压来影响产油微生物生长。目前探讨渗透压对产油微生物影响时，主要针对钠离子、钾离子，而其他金属离子是否通过改变渗透压影响产油微生物，已有文献中探讨较少。

研究发现，在外加金属离子（钠离子、钾离子）渗透压胁迫下，微生物可以通过合成一定量兼容的渗透调节物质来调整细胞的渗透势和膨压，以适应外界环境的渗透势变化，这种机制普遍存在于所有生物之中。这类渗透调节物被称为“相容性溶质”，目前发现的相容性溶质可以分为3种：氨基酸（如Pro）、季胺类化合物（如甜菜碱）以及多元醇或多元糖（ 如甘油、甘露醇、山梨醇和蔗糖）[17]。本文作者课题组在考察了不同渗透胁迫（0、10g/L、20g/L、30g/L和40g/L NaCl）对裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）HX-308发酵产DHA及脂肪酸构成的影响。结果表明：20 g/L NaCl最有利于裂殖壶菌生长和DHA积累，此外，在低渗（10g/L NaCl）和高渗（40g/L NaCl）条件下，外源添加相容性溶质也能有效促进裂殖壶菌积累DHA[18]。

BOROWITZKA等[19]发现添加NaCl改变杜氏盐藻（Dunaliella）渗透压情况下，可以影响甘油酯的合成。HO等[20]在研究渗透压对海洋产油微藻影响时，发现添加NaCl浓度为1mol/L时，微藻油脂含量较0.5mol/L提高10％左右。FUJII等[21]在产油菌株布朗尼葡萄藻（Boekelovia hooglandii）发酵中，加入不同浓度的NaCl，发现在一定范围内NaCl浓度的提高，有助于脂肪酸链的延长和不饱和程度的提高。这些例子均可能是微生物自身产生相容性物质来抵消渗透压变化的结果，不同微生物产生的相容性物质不同（裂殖壶菌是甘氨酸甜菜碱），因此，通过了解相容性溶质对微生物的影响机理，在改变渗透压的同时配合添加特定的相容性溶质，也会有助于微生物生长性能提高。

事实上，某些金属离子还可以通过改变细胞通透性控制膜上的物质转运来影响产油微生物代谢活动，其中钙离子是其中典型的例子。崔振阳[22]在皮状丝孢酵母发酵中添加4.0g/L的CaCl2，发现酵母的生物量和油脂产量分别提高1.0g/L和0.1g/L，表明钙离子虽然对油脂产量的影响不大，但可以提高皮状丝孢酵母底物的转化率。李静[23]对斯达油脂酵母（Lipomycesstarkeyi）发酵产油脂中也发现添加一定量钙离子可以提高底物转化率。这可能是由于添加的钙离子使营养物质更易进入细胞，细胞代谢物也能及时排出胞外。

2.3金属离子对产油微生物关键酶活力的调节

微生物发酵可分为两个阶段，即菌体增殖期和油脂积累期。发酵的前期为菌体增殖期，这个时期微生物要消耗培养基中的碳、氮源，以保持菌体旺盛的代谢和增殖过程。在油脂积累期，微生物将过量的碳水化合物转化为脂类。金属离子对上述两个时期的关键酶都有复杂的调控机制[24-25]。

在产油微生物培养基中，钠离子是最常添加的金属离子。钠离子在一定程度上会提高油脂的不饱和度，使得油脂中多不饱和脂肪酸比例升高[20]。然而，JOHNSON等[26]发现过高浓度的NaCl会抑制戊糖磷酸异构酶、核酮糖二磷酸羧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和磷酸己糖异构酶，从而限制油脂合成前体乙酰-CoA的合成。

钾离子能参与细胞内的蛋白质合成和能量代谢。例如细胞内的苹果酸脱羧作用、ATP的形成、磷的传递等，都需要钾离子参与[27]。细胞膜上的钾离子通道会受到来自胞外刺激物和胞内脂肪酸如（花生四烯酸）的共同作用。在细胞接收外界或者自身内源性刺激时，离子通道开放，能使钾离子在细胞质中的浓度迅速升高。随后通过钾离子敏感的酶和功能蛋白，改变细胞内原有的代谢方式和基因表达模式，最终使得有机体更好地适应外界环境的变化[28]。在产油微生物发酵中，JIN等[29]发现在高山被孢霉（Mortierella alpina）产花生四烯酸的老化阶段，添加一定量的KNO3，当KNO3浓度达到2.62 g/L时，使油脂产量提高了1.55倍。该作者认为这可能是由于添加钾离子能提高了油脂合成的某些蛋白酶活性，使高山被孢霉的油脂合成速率加快。

钙离子能激活α-酮戊二酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶，使代谢向有利于油脂合成代谢的方向进行。但是钙离子浓度过高会抑制脱不饱和酶活性，不利于多不饱和脂肪酸形成。另外，钙离子还可以促使细胞线粒体内ATP的合成，为微生物的生长提供能量，从而促进微生物生长和油脂积累[30]。最近，有文献报道钠离子可以调控钙离子进入胞内，胞内钙离子浓度上升从而激发油脂积累中的钙调蛋白，促进油脂积累[31]。此外，XU等[31]对药用真菌灵芝产次级代谢产物灵芝酸，当配合添加100mmol/L的钠离子时，总灵芝酸的含量达到90.5mg/g干细胞，其产量达到1.58g/L±0.03g/L，比对照组提高了4.03倍，这可能是由于钠离子的添加使得信号转导和钙离子通道蛋白有关基因上调，使胞内钙离子浓度上升，因为当加入环孢素A（可抑制钙离子通道蛋白的功能）后，发现这种促进作用受到了抑制。

镁离子是丙酮酸脱羧酶、丙酮酸激酶、己糖激酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、柠檬酸裂解酶、异柠檬酸脱氢酶等的辅助因子，在糖酵解、呼吸作用、氧化磷酸化等过程中起着重要调节作用。镁离子可以结合到油脂合成中的关键酶上，通过影响酶的结构完整性从而影响油脂的合成[32]。JERNEJC等[30]在黑曲霉添加镁离子，发现苹果酸酶活性得到提高，从而增加还原力（NADPH）的形成，提高了多不饱和脂肪酸的合成量。

一些微量金属元素，如铁、锰、锌、铜等，也会对油脂合成酶有很大影响。例如，铁离子存在于细胞色素、铁氧还蛋白中，是氧化还原载体和电子传递链的组成部分，在有氧呼吸传递电子和柠檬酸循环催化琥珀酸生成延胡索酸的过程中起着重要的作用。蒋汉明等[33]在利用三角褐指藻发酵产油脂中，发现添加一定的铁离子会影响三角褐指藻内去饱和酶的活性，使得油脂中不饱和脂肪酸占总脂肪酸的比例升高。锰离子会提高酰基激酶和酰基-CoA合成酶的活性，致使更多乙酰-CoA流向脂肪合成途径。有研究表明，锰离子比镁离子更能促进苹果酸酶（malic enzyme）的活性，可以促进为油脂的合成提供还原力（NADPH）的苹果酸脱氧反应[23]。然而，锰离子添加量过大可能会抑制其它酶的活性，不利于油脂积累。

王安琪等[34]对轮梗霉的研究表明，在Mn2+的添加浓度为5×10−4mol/L时，发现对生物量略有抑制，但是可以显著提高花生四烯酸的积累。王莉等[13]在研究金属离子对丝孢酵母（Trichosporon）发酵产油脂的影响中，发现与仅添加锰离子相比，在低浓度锰离子、镁离子共存的条件下，菌体的生物量、油脂产量和油脂系数均显著增加。锌离子也是油脂积累过程中酶的激活剂，适量添加锌离子可以提高丙酮酸脱羧酶、苹果酸脱氢酶及3-磷酸甘油醛脱氢酶的活性，促进糖酵解进行，进而调节细胞的代谢，从而促进油脂的合成和积累[35]。此外，杨革等[36]发现低浓度的锌离子直接参与了脂肪酸的脱饱和作用，构成了脱饱和酶的催化活性部位。低浓度锌离子对脱饱和酶是一种激活剂，高浓度锌离子又能抑制该酶的活性，使菌体的脱饱和作用能力下降，造成菌体内多价不饱和脂肪酸——花生四烯酸含量减少。对于铜离子而言，已有研究发现铜离子的添加，对大多数产油微生物的生长和油脂积累都会有副作用。原因可能是铜离子可以和镁离子或锰离子等竞争性结合苹果酸酶的活性位点，从而抑制苹果酸酶的活性[30]。表1总结了典型产油微生物金属离子较适宜的添加量；表2对金属离子对产油微生物内酶活力的影响作了总结。

3　总结与展望

表1　典型产油微生物金属离子添加量

综上所述，目前已发现金属离子能显著影响产油微生物的生理状态，有些作用在微生物生长阶段，有些作用在油脂积累阶段。金属离子不仅能调控酶的活性从而改变代谢途径，而且能影响菌体细胞渗透压、物质运输、微环境的酸碱性；甚至在一些金属离子的添加下，菌丝体外观形态也发生迥然的变化。在对产油微生物研究时，应基于整个代谢流的方向，通过调节金属离子的添加量和不同金属离子的添加配比实现代谢流向更有利于油脂积累方向进行。展望未来，针对产油微生物发酵生产中的金属离子，应考虑以下问题。

（1）不同产油微生物的金属离子添加策略应“因菌而异”。这是由于不同产油微生物的脂肪酸合成途径不尽相同，如存在FAS和PKS等不同途径，发挥关键作用的酶及其调节金属离子有差异；再者，不同微生物对金属离子产生的效应也不同，有些产油微生物可能对金属离子异常敏感，添加金属离子量稍高即会降低其生物量和油脂产量。因此，金属离子对所有产油微生物不会有普遍的添加策略，必须先从分析该微生物代谢途径入手，找出关键途径，据此制定特定的金属离子添加策略。

（2）不同的金属离子可能会竞争同一个关键酶的活性位点，如铜离子和镁离子会竞争性地与苹果酸酶活性位点结合。因此，在金属离子添加时，一定要弄清楚不同金属离子的作用位点，考虑不同金属离子间是否存在相互竞争作用，以保证关键蛋白酶能发挥正常功能。

表2　金属离子对产油微生物酶的作用

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研究开发

Progress on effects of metal ions on lipid accumulation of oleaginous microorganism

LI Tao，JI Xiaojun，WU Na，ZONG Jiajun，HUANG He，YU Yadong
（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，Jiangsu，China）

Abstract：Using oleaginous microorganism to produce lipid is meaningful for overcoming fossil-fuel shortage and improving human life quality. Metal ions can affect the growth morphology，intra-/extra-cellular osmotic pressure and the activity of the key enzyme during the oleaginous microorganism lipid accumulation. Therefore，metal ions are important regulators for oleaginous microorganism. In this review，we discussed the mechanism of oleaginous microorganism lipid accumulation and then explained which metal ions affected oleaginous microorganism and how. Finally，we gave some suggestions on the future studies in exploring the role of metal ions in oleaginous microorganism fermentation process. In order to develop feasible metal ion addition and control strategy for oleaginous microorganism，the following factors might need to be considered. First，we should find the key enzyme from various lipid synthesis pathway of oleaginous microorganism. Then we should fully consider the metal ion tolerance of the target oleaginous microorganism，the effects of different metal ion on the microorganism morphology and the activities of the key intracellular enzymes. Moreover，we should explore the competitive or collaborativerelationship among different metal ions when these metal ions could all affect the active centers of the key enzymes.

Key word：metal ions; enzyme; oleaginous microorganism; metabolism; fermentation; polyunsaturated fatty acids; lipid

中图分类号：Q 936

文献标志码：A

文章编号：1000–6613（2016）04–1173–07

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.04.033

收稿日期：2015-09-14；修改稿日期：2015-12-02。

基金项目：国家自然科学基金（21506096，21476111）、国家高技术研究发展计划（2014AA021703）、江苏省自然科学基金（BK20131405）、农业部农产品加工重点实验室开放课题（2015011）及江苏高校优势学科建设工程项目。