聚乳酸/胶原蛋白取向纳米纤维支架的性能

贾 琳, 王西贤, 张海霞, 覃小红,2

(1. 河南工程学院 河南省服用纺织品工程技术研究中心， 河南 郑州 450007； 2. 东华大学 纺织学院， 上海 201620)

聚乳酸/胶原蛋白取向纳米纤维支架的性能

贾 琳1, 王西贤1, 张海霞1, 覃小红1,2

(1. 河南工程学院 河南省服用纺织品工程技术研究中心， 河南 郑州 450007； 2. 东华大学 纺织学院， 上海 201620)

为研究取向纳米纤维的性能及取向纳米纤维对细胞生长的引导作用，利用可降解的聚乳酸和胶原蛋白为原料，通过静电纺丝方法制备了随机和取向排列的聚乳酸(PLLA)、聚乳酸/胶原蛋白(PLLA/Coll)纳米纤维支架材料。利用扫描电镜、红外光谱仪等研究了纳米纤维的形态结构、化学性能和力学性能等，并在其表面培养间充质干细胞(MSCs)，研究细胞在不同的支架表面的生长形态。结果表明：取向纳米纤维具有较细的纤维直径，各向异性的结构性能，平行于纤维排列方向的润湿性能和优于垂直于纤维排列方向的断裂强度。复合PLLA/Coll支架表面含有细胞识别基团，能增强细胞的黏附和增殖，培养在取向PLLA/Coll纳米纤维支架上的MSCs呈现取向的纺锥形态，与体内MSCs的形态更类似。

取向纳米纤维； 胶原蛋白； 支架材料； 力学性能； 细胞取向

静电纺丝是制备纳米纤维最有效、最简便的方法之一。静电纺纳米纤维因其较大的比表面积和较高的孔隙率，被越来越多的研究者应用到不同领域，包括过滤材料、组织工程、药物缓释系统等。然而，传统的静电纺纳米纤维呈现杂乱无序的排列状态，力学强度较差，一定程度上限制了纳米纤维的应用。而取向排列的纳米纤维不仅具有较高的力学强度，其各向异性的微观结构与人体内细胞外基质的微观结构更类似，可以引导细胞的取向生长和定向迁移，是更好的组织工程支架材料。Xu等[1]曾经利用旋转的收集装置制备了取向排列的聚丙交酯-己内酯(PLCL)纳米纤维，并在其表面培养平滑肌细胞，结果表明平滑肌细胞具有延伸的形态结构，与体内的细胞形态更类似。Gupta等[2]在取向排列的聚己内酯(PCL)/明胶纳米纤维表面培养神经雪旺细胞，结果表明取向的纳米纤维可以引导细胞的取向生长。

由于合成的生物高分子材料价格便宜，力学强度高，生物毒性小，近年来，利用静电纺丝方法，许多生物高分子纳米纤维支架材料被应用到组织工程中。聚乳酸(PLLA)具有较好的力学性能及生物相容性和生物降解性，是应用最多的组织工程支架材料[3-4]，但是，PLLA本身缺少一些细胞识别的功能基团，如氨基和羧基，单独作为支架材料时不利于细胞的增殖和生长；而胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分，是人体含量最多的蛋白，具有无免疫原性，低抗原性，较高的亲水性和细胞相容性[5-6]。因此，本文将胶原蛋白加入到PLLA溶液中，通过静电纺丝方法制备随机和取向排列的聚乳酸/胶原蛋白(PLLA/Coll)纳米纤维，分析比较纳米纤维的微观形貌，亲水性，化学性能和力学性能，并在其表面培养细胞，研究取向纳米纤维引导细胞取向生长的作用。

1 实验部分

1.1 主要材料与仪器

聚乳酸(相对分子质量为30 000)，I型胶原蛋白，六氟异丙醇(HFIP)，间充质干细胞(MSCs)。

CO2恒温培养箱，FEI- QUANTA 200 F型扫描电子显微镜(SEM)，渗透孔隙率仪，水接触角测试仪，傅里叶红外光谱分析仪，Instron5345型拉伸试验机。

1.2 实验方法

1.2.1 纳米纤维支架的制备

称取一定质量的PLLA并置于5mL的蓝口瓶中，然后加入一定比例的HFIP溶剂，配制质量分数为3%的PLLA溶液，在室温条件下放在磁力搅拌器上搅拌24 h后待用，搅拌速度为500 r/min。按质量比为3∶1、1∶1的比例称取一定量的PLLA和胶原蛋白，加入HFIE溶剂，配制质量分数为3%的PLLA/Coll溶液，混合搅拌24 h后待用。

用3 mL的注射器抽取聚合物溶液并放置在注射泵上控制溶液的流速，纺丝液流速为1.0 mL/h；将注射器针头接正极高压并调节纺丝电压为15 kV，接收距离为12 cm。利用接地的铝箔接收随机排列的纳米纤维(将制备的随机排列的纯PLLA、质量比为3∶1和1∶1的混合PLLA/Coll膜分别编号为1#～3#)，利用旋转的滚轴收集取向纳米纤维(将制备的取向排列的纯PLLA、质量比为3∶1和1∶1的混合PLLA/Coll膜分别编号为4#～ 6#)，旋转速度是2 000 r/min。将纳米纤维喷射到直径为15 cm的盖玻片上作为组织工程支架材料来培养细胞。

1.2.2 纳米纤维支架微观形貌观察

将纳米纤维进行喷金处理，利用扫描电镜观察随机排列和取向排列的纳米纤维的形态特征，随后利用ImageJ软件在纳米纤维的SEM照片中随机选取50根纳米纤维测试纤维直径并求取平均值。

1.2.3 纳米纤维支架孔隙率测试

将从铝箔上剥离的纳米纤维膜裁剪成30 mm×30 mm的样品，在低气压下，利用毛细管渗透孔隙率仪测量随机排列和取向排列纳米纤维的平均孔隙直径。

1.2.4 纳米纤维支架亲水性测试

利用水接触角测试仪测试随机排列和取向排列的纳米纤维的亲水性。将纳米纤维膜放置在测试板上，将去离子水滴在纳米纤维支架表面，每个样品测试5个不同位置的水接触角取其平均值。对于取向纳米纤维，沿平行于和垂直于纤维排列方向分别测试支架材料的水接触角。

1.2.5 纳米纤维支架红外光谱分析

将纳米纤维膜从铝箔上剥离下来直接在红外光谱分析仪上分析，红外光谱的波数范围为4 000～400 cm-1，分辨率为2 cm-1。

1.2.6 纳米纤维支架力学性能测试

利用样品框架将纳米纤维支架裁剪成尺寸为10 mm×20 mm的样品，使用拉伸试验机对样品进行机械拉伸性能测试，拉伸力为10 N，拉伸速度为10 mm/min，最后根据应力-应变曲线计算样品的拉伸强度和断裂伸长率。对于取向纳米纤维，沿平行(PL表示)于和垂直(PP表示)于纤维排列方向分别测试支架材料的拉伸性能。

1.2.7 细胞形貌表征

将覆盖有随机排列和取向排列的PLLA、PLLA/Coll纳米纤维的盖玻片置于24孔板底部，利用紫外线对样品照射2 h进行消毒。在不同纳米纤维表面培养间充质干细胞(MSCs)，密度是每孔8 000个细胞。然后将细胞放入培养箱中培养(标准环境37 ℃，5%CO2)，每隔2 d换1次培养液，10 d后取出，用PBS缓冲液(pH=7.4)清洗残余的培养液，并用3%的戊二醛对细胞固定3 h，然后用质量分数为50%、70%、90%、100%的乙醇溶液分别对细胞进行脱水处理，每种溶液脱水10 min。最后，将样品放置在通风橱中，使水分充分挥发，放置在扫描电子显微镜下观察细胞的结构形态。

2 结果分析

2.1 纳米纤维支架的微观形貌

随机排列和取向排列的PLLA、PLLA/Coll纳米纤维扫描电子显微镜照片如图1所示。由图中可以观察到光滑无串珠且均匀分布的纳米纤维，随机排列的纳米纤维显示了杂乱无序的排列状态，而取向排列的纳米纤维显示了取向的排列状态。随机排列的1#、2#、3#纳米纤维的直径分别为(430±90)nm，(270±120)nm和(210±160)nm，而取向排列的4#、5#、6#纳米纤维的直径分别为(415±105)nm,(257±115)nm和(198±145)nm。可以看出，无论是纯PLLA还是复合的PLLA/Coll纳米纤维，取向纳米纤维的直径略小于随机排列的纳米纤维，这主要是由于高速旋转的滚轴在滚筒表面产生的拉伸力使纳米纤维得到进一步拉伸，所以取向纳米纤维直径较小。Kai等利用高速旋转的圆盘制备了取向排列的PCL和PCL/明胶纳米纤维，结果发现相对于普通的纳米纤维，取向排列的纳米纤维直径较小，本文的结果与文献[7]相似。

无论纳米纤维的排列方式如何，相对于纯PLLA纳米纤维，胶原蛋白的加入有效地减小了复合PLLA/Coll纳米纤维的直径。这主要是由于胶原蛋白的加入增加了PLLA/Coll溶液的导电性，胶原蛋白是两性电解质，在有机溶液内能解离产生正电荷或负电荷，增加溶液的电导率，所以PLLA/Coll复合纳米纤维的直径较小[8]。对比取向PLLA和PLLA/Coll纳米纤维的取向排列程度，可以发现PLLA纳米纤维的取向排列程度高于PLLA/Coll纳米纤维，Schnell等[9]制备了取向的PCL和PCL/Coll纳米纤维，得到了类似的结果，并分析原因是胶原蛋白的加入降低了溶液的黏度，使纳米纤维取向度降低。

2.2 纳米纤维支架的孔隙率

纳米纤维的孔隙率和孔隙直径对纳米纤维的应用有很大的影响，特别是在组织工程、过滤材料和药物释放等方面。有研究表明，纤维膜厚度和纤维直径对纳米纤维膜的孔隙直径有较大的影响[10]，当纤维膜厚度一定时，孔隙直径与纤维直径成正比例关系。本文纳米纤维膜的厚度约为35 μm，随机排列和取向排列的纳米纤维的孔隙直径见表1所示。随着胶原蛋白的加入，纤维直径减小，孔隙直径也随之减小。另一方面，相对于随机排列的纳米纤维，取向排列的纳米纤维具有较小的纤维直径，但其孔隙直径却较大，这主要是因为取向纳米纤维呈现单一方面的排列状态，孔隙直径呈阶梯状分布，孔隙直径分布不均匀，孔隙率较差，因此平均孔隙直径较大。Meng等[11]制备了随机排列和取向排列的聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)/明胶纳米纤维，取向排列的纳米纤维具有较小的孔径和较大的孔隙率。

2.3 纳米纤维支架的亲水性能

纳米纤维支架材料的亲水性影响其表面能，并进一步影响血清蛋白的黏附，对细胞在其表面的黏附和增殖有很大的影响，利用水接触角来描述支架材料的亲水性能，水接触角越大，亲水性越差，反之亦然。由表1可见纳米纤维支架的水接触角，纯PLLA纳米纤维的水接触角为133.4°，亲水性非常差，不利于细胞的黏附生长；而复合PLLA/Coll纳米纤维具有非常好的亲水性，其水接触角为34.2°和42.3°，且亲水性随着胶原蛋白含量的增加而提高，有利于MSCs在其表面的黏附和增殖。另一方面，取向的PLLA和PLLA/Coll纳米纤维表现了各向异性的润湿性能，垂直于纤维排列方向的水接触角大于平行于纤维排列方向的水接触角，这主要是由于当液滴沿垂直方向流动时，由于纤维微观沟槽所形成的能量位垒，阻止液滴在该方向的延伸流动，因此水接触角较高，润湿性略差[12]。反之，在当水滴沿平行方向流动时，因为不存在纤维微观沟槽形成的位垒阻力，液滴流动较快，水接触角较小，润湿性较好。总之，胶原蛋白的加入有效地提高了纳米纤维的亲水性，有利于细胞的黏附生长；另外，取向纳米纤维直径材料表现了各向异性的润湿性能，将引导细胞的取向排列和生长。

表1 纳米纤维的直径和亲水性能Tab.1 Diameter and hydrophility of nanofibers

2.4 纳米纤维支架的红外光谱分析

2.5 纳米纤维的力学性能

除了微观形态和化学性能，纳米纤维支架材料的拉伸性能也是其在组织工程应用的一个关键因素。图3示出随机排列和取向排列纳米纤维支架材料的拉伸曲线。

对于随机排列的纳米纤维支架，当受到持续的拉伸作用时，由于杂乱交错的排列状态，纤维之间会沿拉伸方向滑动，其断裂强度呈先线性增加再非线性增加的趋势。比较图中1#、2#、3#号试样的拉伸曲线，发现复合的PLLA/Coll纳米纤维支架具有较高的断裂强度，但其断裂伸长率小于纯PLLA纳米纤维。比较图3(b)、(c)中4#、5#、6#号试样的拉伸曲线可知，虽然4#试样取向PLLA具有较大的断裂伸长率，但5#试样取向PLLA/Coll(3∶1)具有最大的拉伸强度。由此可知，PLLA纳米纤维支架具有较高的断裂拉伸率，但其断裂强度较小，拉伸模量较大，不能承受较高的生理压力，不适宜单独作为组织工程支架材料；而胶原蛋白的加入会降低PLLA/Coll纳米纤维膜的拉伸模量，提高其断裂强度，而且胶原蛋白内部含有细胞识别的基团，因此更适宜做组织工程支架材料。由图3还可知，取向的纳米纤维支架具有各向异性的拉伸性能，沿纤维平行方向的拉伸强度远远大于随机排列的纳米纤维膜的拉伸强度和纤维垂直方向的拉伸强度，且由于取向纳米纤维中纤维单一方向的排列状态，随机排列的纳米纤维膜的拉伸强度处于纤维垂直方向的拉伸强度与纤维平行方向的拉伸强度之间。由于纳米纤维沿单一方向排列，当取向纳米纤维膜受到平行于纤维方向的作用力时，纤维之间沿该方向的拉伸滑动减小，所以其断裂伸长率最小。

2.6 体外生物相容性

纳米纤维的取向排列状态对其表面的细胞形态和细胞黏附等有很大的影响。图4示出不同纳米纤维支架表面MSCs的SEM照片。由图可明显看出，无论纳米纤维形态如何，复合PLLA/Coll支架表面的细胞数目均远远高于纯PLLA支架，这主要是由于PLLA/Coll支架表面存在细胞识别基团氨基和酰胺基，增加了细胞在其表面的黏附生长。随机排列的PLLA和PLLA/Coll纳米纤维表面的MSCs呈现随机的排列状态，且细胞呈宽扁的多边形状态；而培养在取向纳米纤维表面的MSCs呈现取向的排列状态，沿纤维方向取向生长，且细胞呈细长的、被拉伸的纺锥形态(见图中白色箭头)，与体内MSCs的形态更类似，说明取向纳米纤维通过表面微观形态的接触引导作用、各向异性的润湿性能引导细胞的取向生长和定向排列。另一方面，比较取向的PLLA和PLLA/Coll纳米纤维表面的细胞形态可以发现，尽管取向PLLA纳米纤维的取向排列程度更好，但是取向PLLA/Coll表面的MSCs的取向排列程度却高于取向PLLA表面的MSCs，表明胶原蛋白的存在不仅可以有效地增加MSCs在其表面的黏附增殖，还可以增加MSCs的取向排列程度，该结果表明不仅支架材料的物理结构形态可以改变细胞的生长行为，支架材料的化学组成也会影响细胞的黏附和生长等行为。

3 结 论

本文利用静电纺丝方法成功制备了随机和取向排列的PLLA、PLLA/Coll纳米纤维，由于旋转滚筒产生的拉伸力，取向纳米纤维的直径略低于随机排列的纳米纤维，胶原蛋白的加入有效地降低了复合PLLA/Coll纳米纤维支架的纤维直径和孔隙直径，提高其亲水性，提高了其拉伸强度。取向纳米纤维具有各向异性的润湿性能和机械拉伸强度，其平行于纤维排列方向的润湿性能和断裂强度都大于垂直于纤维排列方向。胶原蛋白的加入有效地提高了MSCs的黏附生长，由于微观形态和化学组成2个方面的接触引导作用，培养在取向PLLA/Coll纳米纤维支架的MSCs沿纤维方向取向生长，且显示细长的、被拉伸的纺锥形态，与体内MSCs的形态更类似。

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Performance of aligned polylactic acid/collagen nanofibrous scaffolds

JIA Lin1, WANG Xixian1, ZHANG Haixia1, QIN Xiaohong1,2

(1. Henan Clothing Textiles Engineering Research Center, Henan University of Engineering, Zhengzhou, Henan 450007, China; 2. College of Textiles, Donghua University, Shanghai 201620, China)

Biodegradable polylactic acid (PLLA) and collagen were chosen as raw materials. PLLA and polylactic acid/collagen (PLLA/Coll) nanofibrous scaffolds with different morphologies (randomness and alignment) were prepared by electrospinning to study the properties and the guiding function of aligned nanofiber for the cell growing. Firstly, the morphologies, chemical and mechanical characterizations of different nanofibrous scaffolds were carried out. Then mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured and the attachment and proliferation of cells on different scaffolds were evaluated. The results show that aligned nanofibers possess thinner fiber diameter,anisotropic morphology and performance, and the wettability and mechanical properties in parallel direction are better than those in perpendicular direction. Composite PLLA/Coll scaffolds have cell-recognition moieties, which can improve the attachment and proliferation of cells. Hence, MSCs cultured on aligned PLLA/Coll scaffolds express aligned spindle phenotype, more similar to the phenotype of native MSCs.

aligned nanofiber; collagen; scaffold material; mechanical performance; cell orientation

10.13475/j.fzxb.20160102506

2016-01-20

2016-06-19

河南省高校科技创新团队支持计划(13IRTSTHN024，15IRTSTHN011)；河南省高校重点科研项目(15A540001)；河南省重点科技攻关项目(152102210301)；河南工程学院博士基金项目(D2014025)

贾琳(1986—)，女，讲师，博士。主要研究方向为静电纺纳米纤维的制备及应用。E-mail：lynnjia0328@163.com。

TS 102.6

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