富血小板血浆对人脂肪来源干细胞增殖率的影响

梁茜　潘福强　梁羽冰　黎冻

[摘要]目的：探讨不同比例富血小板血浆（Platelet-rich plasma，PRP）对人脂肪来源干细胞（adipose-derived stemcells，ADSCs）的增殖及周期蛋白Cyclin D₁表达的影响。方法：分离培养ADSCs细胞，传代至第3代，流式细胞仪鉴定。全血中分离PRP。采用随机数字表法将将细胞分为4组（n=24）：C组不做任何处理，PRP₁₀组、PRP₂₀组和PRP₃₀组在ADSCs中加入PRP使其容积比分别为10%、20%和30%，于37℃、5%C02培养箱中培养。应用MTT法检测各组细胞的增殖率，蛋白免疫印迹法（Western blot）测细胞周期蛋白Cyclin D₁的表达。结果：与C组比较，PRP₁₀组、PRP₂₀组、PRP₃₀组ADSCs细胞增殖率及Cyclin D₁蛋白的表达明显增高（P<0.05）；组间比较PRP₃₀组ADSCs细胞增殖率及cyclin D₁蛋白的表达高于PRP₁₀组和PRP₂₀组（P<0.05）。结论：PRP以浓度依赖性方式促进ADSCs细胞内周期蛋白Cyclin D₁的表达，从而促进ADSCs的增殖。

[关键词]脂肪移植；脂肪来源干细胞；细胞增殖率；富血小板血浆；Cyclin D₁蛋白

[中图分类号]Q813.1 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2016）03-0036-03

临床上常因畸形、外伤、术后及美容等的需要而行软组织缺损修复术。目前常用的移植填充材料主要有人工材料和自体组织。由于人工材料移植后可能出现排除反应、感染及移位等并发症，在临床使用中受限。人体自身脂肪组织移植可避免上述并发症，因其来源丰富，抽取脂肪后供区无明显并发症，理论上为最理想的填充材料。然而目前自体脂肪移植面临最大的问题为移植后易被吸收，远期成活率较低。研究报道脂肪细胞经体外培养后能获得稳定生长、增殖能力强，且具备定向分化的干细胞。ADSCs作为可大量增殖的主要干细胞群，成为近年来脂肪移植研究的热点。富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）为自体血小板的浓缩体，内含高浓度生长因子，包括PDGF、TGF-B、VEGF、b-FGF、IGF-1等。有研究报道富血小板血浆联合脂肪来源干细胞移植能显著提高脂肪移植成功率。但具体的机制尚未完全清楚，本研究拟通过不同体积比例的富血小板血浆对脂肪来源干细胞增殖及周期蛋白CyclinD1表达的影响，探讨其可能机制，为临床提供依据。

1 材料和方法

1.1 取材

脂肪组织来源干细胞及富血小板血浆来自广西医科大学一附院美容整形外科接受脂肪抽脂术的女性患者1例，年龄28岁，排除糖尿病、冠心病、高血压及其他传染病患者。手术前签署知情同意书。

1.2 试剂

DMEM细胞培养基及胎牛血清均购于Gibco公司；胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、MTT购于Sigma公司；流式细胞试剂盒购自南京凯基生物公司；CyclinD1抗体、β-actin抗体购自CST公司。

1.3 细胞的分离培养

注射器负压抽吸法抽取患者大腿后侧脂肪组织，加入0.1%胶原酶Ⅰ，37℃水浴箱消化30min；加入含血清的种板培养基（90%DME-F12，10%胎牛血清，0.2mol/lL谷氨酰胺，100U/ml青霉素、100U/ml链霉素）终止消化，1000rpm离心5min；弃上清，加入0.075mmol/l氯化钾，静置10min后离心弃上清，加入10%含胎牛血清的DMEM培养液中，移入培养皿。于37℃、5%CO₂培养箱中培养，随后隔天更换培养液。待细胞进入对数生长期后，用0.25%的胰酶消化，按1：3的比例进行传代。

1.4 流式细胞仪鉴定脂肪来源干细胞

将传代到第3代的ADSCs用0.25%的胰酶消化10min，将消化液收集到离心管中，加入培养液终止消化，1000rpm离心5min；弃上清，用D-Hanks冲洗重悬细胞，再次1000rpm离心5min；弃上清。D-Hanks将细胞重悬使细胞浓度约为1×10⁶/ml，同时设置阴性对照和同型对照。按照说明书加入CD45-PE，CD90-PE，CD106-PE单克隆抗体，4℃避光孵育30min离心，1000rpm离心5min；弃上清。PBS漂洗3次，加入200μl的PBS重悬细胞，流式细胞仪分析标记细胞。

1.5 富血小板血浆（PRP）提取及血小板计数

抽取患者约35ml外周血液，充分混匀，取0.5ml行全血PLT计数，余血液分装至离心管，每管10ml：无菌条件下离心，4℃，l700rpm离心5min，管内液体分为上层清液和红细胞层，吸取全部上清至另一离心管；4℃，3200rpm离心5min，管内液体上层为淡黄色贫血小板血浆，离心管底部黄褐色层为浓缩血小板，弃去约3/4上清液，剩余液体混匀即为PRP，对其行PLT计数。

1.6 实验分组

根据PRP容积比例不同将实验分为对照组（C组）、PRP₁₀组、PRP₂₀组、PRP₃₀组；C组不做任何处理，PRP₁₀、PRP₂₀组、PRP₃₀组在ADSCs中分别加入PRP使其容积比为10%、20%和30%，于37℃、5%CO₂培养箱中培养。

1.7 MTT法测细胞活力

将细胞以1×10⁶/ml密度接种于96孔培养板，200μ1/孔，每组36孔，分别加入不同体积的PRP孵育，同时设空白对照组，分12h、24h、36h、48h、60h、72h六个时段观测；

到达观测时段时，每组取6孔，每孔加入MTT液20μl，37℃、5%CO₂培养箱培养4h；弃培养液，各孔加200μl二甲基亚砜，振荡10min；用酶联仪在490nm波长下检测每孔的吸光值（OD），测定细胞活力，并计算细胞增殖率。细胞增殖率的计算公式为：细胞增殖率（%）=OD_PRP组/OD_对照×100%。

1.8 Westernb lot法检测Cyclin D₁蛋白的表达

用细胞裂解液提取细胞总蛋白，BCA法进行细胞蛋白含量测定。取50μg蛋白在12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转至硝酸纤维素滤膜，5%脱脂奶37℃封闭1h，加入Cyclin D₁抗体（1：1000，CST公司，美国）于4℃孵育过夜；加入HRP标记的羊抗兔IgG抗体（1：6000，Santa Cruz公司，美国），常温孵育30min，曝光成像。以β-actin为内参。应用Quantity One5.0软件（Bio-Rad公司，美国）进行分析，以Cyclin D₁条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值反映Cyclin D₁蛋白的表达。

1.9 统计分析

采用SPSS13.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞实验

培养至第3代的ADSCs经流式细胞仪检测结果显示，CD45和CD106呈阴性表达，CD90呈阳性表达（见图1）。

2.2 富血小板血浆（PRP）提取实验

全血血小板浓度约为2.68×10³/μl，二次离心法得到的PRP中血小板的浓度约为40.2×10⁴/μ1。

2.3 MTT实验及Western blot实验

与C组比较，PRP₁₀组、PRP₂₀组、PRP₃₀组ADSCs细胞增殖率和Cyclin D₁蛋白的表达明显增高（P<0.05）；组间比较PRP₃₀组ADSCs细胞增殖率和Cyclin D₁蛋白的表达明显高于PRP₁₀组和PRP₂₀组（P<0.05）（见表1，表2，图2，图3）。

3 讨论

自体脂肪移植面临的最大挑战是如何提高移植后脂肪细胞的存活率。ADSCs作为脂肪组织中可大量增殖的干细胞群中的主要成分，不仅成为组织工程的理想种子细胞，在自体脂肪移植的整个过程中也发挥着重大作用。研究报道，ADSCs在缺血或者生长因子刺激的条件下释放促血管化因子，且可分化为血管内皮细胞。因此，目前ADSCs被认为是脂肪细胞和血管细胞的双重前体细胞。本实验自人类脂肪组织取材，通过胶原酶消后培养经流式细胞仪鉴定为ADSCs细胞，该方法具有产量丰富、获取过程简单、对人体创伤小等优势。

MTT法又称四唑盐法，经线粒体琥珀酸脱氢酶裂解后生成紫蓝色结晶，紫蓝色结晶的生成量与细胞释放出的酶活性成正比，而酶的活性与细胞的数量及细胞活力成正比，因而可利用该方法间接反应ADSCs细胞的活力及增殖率。本研究结果提示PRP以浓度依赖性方式促进ADSCs增殖。

细胞周期是指细胞从上一次分裂结束到下一次分裂完成所经历的过程，是细胞生命活动中一个最重要的过程。而细胞周期的有序性驱动主要依赖于CDKs（cyclindependent-kinase，细胞周期蛋白依赖性激酶）为核心的网络调控系统，其中Cyclin D₁蛋白是调控细胞周期的关键蛋白，对决定细胞是否进而分裂至关重要。研究报道细胞内外的各种生长因子及有丝分裂的信号通过作用于可分裂细胞内的Cyclin D₁，使其表达上升从而促使细胞进入分裂期。

本研究结果表明PRP以浓度依赖性的方式提高ADSCs细胞活力及增值率，同时ADSCs细胞Cyclin D₁蛋白表达增加，提示PRP通过促进ADSCs细胞增殖的机制与促进Cyclin D₁蛋白表达上调有关。

总之，PRP以浓度依赖性方式促进ADSCs细胞Cyclin D₁蛋白的表达，提高ADSCs细胞增殖率。

编辑/张惠娟