4个苹果品种和2种砧木试管苗对热处理脱毒效应的研究

康晓育 李帼英 赵新红

摘要：本试验采用变温热处理结合茎尖培养对4个苹果品种和2种砧木组培苗脱除潜隐性病毒的效应进行了研究。结果表明：不同的苹果品种和砧木耐热性不同。其中王林、珠美海棠的耐热性最强，L—6、金矮生的耐热性居中，首红、天汪1号耐热性最差。在相同处理条件下，不同的苹果基因型脱毒率存在差异。其中王林脱毒效率最高，3种病毒的同时脱除率达到100%；金矮生ACLSV和ASPV两种病毒的同时脱除率达到100%；ASGV的脱除率也在80%以上；株美海棠、L—6、天汪1号、首红的脱除率较低。另外，不同病毒种类脱除的难易程度也存有差异，ACLSV最容易脱除，ASGV最难脱除，ASPV居中。

关键词：苹果品种；砧木；热处理；脱毒率

文章编号：1005-345X（2016）04-0001-04 中图分类号：S661.1 文献标识码：A

苹果是世界四大水果之一，以其丰富的营养价值和较高的经济效益而成为世界上主要栽培的经济果树。病毒病害是苹果生产上的主要病害之一，苹果树受病毒侵染后，病毒在细胞核内增殖，干扰、破坏树体的正常生理机能，导致生长势减退，产量下降，品质变劣，因此，果树无毒化栽培已成为现代果树产业发展的方向。

苹果潜隐性病毒包括苹果茎痘病毒（AS—PV）、苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）。该类病毒虽无明显症状，但可导致果树树势变弱，果品品质变劣，给果树生产带来极大危害。目前主要通过茎尖培养、热处理结合茎尖培养进行脱除。传统的病毒检测一般采用酶联免疫法，随着分子生物学技术的发展，目前逐渐被先进的RT—PCR方法代替。由于不同的果树品种有其不同的结构和生理特点，因此脱毒效率各不相同。

本试验以4个苹果品种和2种砧木为试材，采用热处理结合茎尖培养进行脱毒处理，比较不同基因型和砧木在脱毒过程中的反应和脱毒效率，以期为苹果病毒的脱除方法研究提供指导，同时为苹果品种和砧木无病毒材料的繁育提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

试验在天水市果树研究所植物组培室进行。供试材料为组培室现有苹果砧木试管苗珠美海棠、L—6，苹果品种试管苗天汪1号、王林、首红、金矮生及各品种和砧木田间生长旺梢。试管苗的继代培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.5 mg/L。

1.2试验方法

1.2.1单纯茎尖培养 在新梢生长最快时期（5月中下旬），选择大田生长健壮的母树，采集生长旺盛、长约2～3 cm顶梢，去叶后作为外植体，用洗涤剂水浸3 min后，流水冲洗60～90 min；移入超净工作台上操作，倒入75%的乙醇浸泡30 s，蒸馏水冲洗后放人0.1%升汞（HgCl₂）中消毒10 min，无菌水冲洗3～5次，用灭菌滤纸吸干表面水分，在解剖镜下迅速剥取0.5 mm茎尖进行分离培养。所用培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

1.2.2高温热处理结合茎尖培养方法将茎尖培养诱导形成的分化芽转入MS+6-BA0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L的继代培养基中培养。培养40 d左右时，剪取2～3 cm的芽转接，每品种接10瓶，每瓶4株。先在室温（24～26℃）条件下培养10 d，然后转移到人工气候箱中，白天14 h，晚上10 h，从25℃开始每天升高1℃，逐渐升温至32℃。从32℃开始每天升1℃，继续升温至38℃时，控制温度白天38℃、光照14 h，夜间32℃、10 h，处理30 d。热处理结束后在无菌条件下对存活的组培苗切取未褐变、坏死的茎尖约0.5 mm接种于再生培养基上培养40 d。

1.2.3病毒检测 对热处理后的瓶苗剪取0.5 mm茎尖继续转接在再生培养基中，以单株系进行扩繁，苗数达150～200株时，以1个培养瓶为1个样本，随机抽取3～4个样本，每个样本10～15株，将所选材料送至中国农科院果树研究所中国落叶果树脱毒中心，利用反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）检测方法，检测苹果茎痘病毒（ASPV）、苹果茎沟病毒（ASGV）、苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）。对于单纯茎尖培养脱毒的组培苗采用酶联免疫分析法进行脱毒检测。

1.2.4数据调查与结果统计 热处理28 d后统计茎尖成活率、增殖系数，观察记录植株老叶与新梢的表现症状。热处理后试管苗茎尖成活率统计：增殖系数=1 cm以上的新梢数量/存活株数；茎尖成活率=（转接的成活茎尖数/转接茎尖总数）×100%。病毒检测结果进行脱毒率统计：脱毒率=（检测呈阴性样本数/检测样本总数）×100%。

2结果与分析

2.1单纯茎尖培养脱毒效果

从田间采集6个样品共135个茎尖进行分离培养，成活35个，成活率为25.9%。采用酶联免疫分析法检测结果显示，直接茎尖培养法脱毒效果很低，检测35个苹果茎尖，有2个茎尖脱除了苹果褪绿叶斑病毒，有1个茎尖脱除了苹果茎痘病毒，茎沟病毒则未能脱除。脱除率仅为8.57%（表1）。

2.2热处理+茎尖培养脱毒效果

2.2.1高温热处理对茎尖成活率及植株生长的影响 试管苗的最初培养温度为25℃，逐步升温至38℃，热处理过程中组培苗长期处于高温高湿的微环境中，茎尖特别容易受害褐变死亡，而且死亡程度也各不相同。从表2可看出，不同试材的耐热性存在差异。王林、珠美海棠试材耐热性最强，茎尖成活率较高，老叶小部分枯死，新梢生长良好；L—6、金矮生的耐热性居中，植株老叶受害严重，但茎尖没有受害；首红、天汪1号耐热性最差，茎尖成活率低，老叶基本全部枯死，较短新梢茎尖死亡，部分较长新梢生长良好。另外，4个苹果品种和2种砧木增殖系数也存在明显差异。珠美海棠增殖系数显著高于其余品种或砧木，天汪1号、首红则显著低于其余品种或砧木，且二者之间也存在显著性差异。

2.2.2不同品种和砧木脱毒率的比较 由表3可以看出，3种病毒脱除的难易程度不同，ACLSV最易脱除，6个待检样品其脱除率达到100%；ASPV居中，王林和金矮生脱除率达到100%，其他4个脱除率在80%～95%；ASGV最难脱除，只有王林达到100%的脱除率，其他4个脱除率在65.8%～80.5%。单纯茎尖培养脱除病毒也表现了这种趋势。另外，不同的苹果基因型脱毒效果存在差别，其中王林脱毒效率最高，3种病毒的同时脱除率达到100%。金矮生ACLSV和ASPV两种病毒的同时脱除率达到100%，ASGV的脱除率也在80%以上。株美海棠、L—6、天汪1号、首红的脱除率较低。

3讨论

在茎尖脱毒技术中，因外植体大小不同，成活率和脱毒率相互制约，从脱毒这一目标来看，要求茎尖越小越好，但是茎尖太小，自身营养就不足，越难分化，加之切分时机械损伤，所以污染率和死亡率也就越高。因此，应该综合考虑成活率和脱毒率两个指标来确定茎尖的大小，本试验采用的是0.5 mm的长度。目前常用的脱毒方法有两种：方法1单纯茎尖培养和方法2热处理结合茎尖培养。综合来说，方法2的脱毒率显著高于方法1，这说明单独使用小茎尖培养很难脱除果树潜隐性病毒，而热处理与小茎尖结合则可以较好地解决这个问题。这与变温热处理结合茎尖培养获得的苗子脱毒效果较好研究结果一致，晏娜等研究报道，采用38℃/32℃变温热处理适合大多数品种和砧木脱除苹果潜隐性病毒。因此，该试验采用38℃/32℃变温热处理对6种试材进行脱毒，发现在相同热处理条件下，苹果基因型不同，病毒脱除效率不同。这与程玉琴等的观点一致。

该研究中，3种病毒各自的脱除率存在显著差异。总体表现为ASGV最难脱，ACLSV最容易脱除，ASPV居中。不同病毒类型脱除率不同的原因，除与热处理条件和寄主有关外，还可能与病毒本身的特性和结构有直接关系。由3种病毒的病原学研究发现三者在形态长度、体外钝化温度和体外保存时间均存在明显差异，且表现出一定的规律性。如在体外钝化温度上，由高到低为ASGV>ASPV>ACLSV；那么这些特性是否与病毒脱除相关，还需要进一步研究。另外研究也表明凡是脱除了ASGV的试材，其他两种病毒也都是脱除了的，而脱除了ACLSV和ASPV的试材，ASGV未必脱除。因此，对携带有ASGV的试材进行脱毒处理后，可首先通过检测ASGV进行初选，再对ASGV检测呈阴性的材料进行其他病毒的检测。这样就可以大大减少病毒检测的成本，提高检测效率。