小麦miRNA研究进展

李洪振 宋金鹏�┝醵�升 胡文刚 宫文萍 刘成 韩冉 刘建军

摘要：microRNA（miRNA）是真核生物体内普遍存在的一类具有重要调控功能的非编码小分子RNA（sRNA）。研究表明，miRNA参与基因转录后调控，在植物的生长、发育和逆境胁迫应答等生物学过程中发挥着重要调节作用。截至目前，对植物miRNA的研究已经取得了较大进展，但小麦miRNA研究才刚具雏形。通过生物信息学预测和sRNA高通量测序手段，已得到部分小麦miRNA。小麦miRNA的功能研究方法也有了初步结果。本文就小麦miRNA的识别、时空表达特性、抗逆相关特性及其功能研究方法进行总结分析，为今后小麦miRNA的研究提供参考。

关键词：miRNA；小麦；高通量测序

中图分类号：S512.101文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）06-0147-05

microRNA（miRNA）是近年来发现的真核生物体内普遍存在的一类具有重要调控功能的非编码小分子RNA（sRNA），其长度在20～25 bp之间。大量研究发现，miRNA参与基因转录后调控，在植物的生长、发育和逆境胁迫应答等生物学过程中发挥着重要的调节作用。迄今，植物miRNA的研究已经取得了较大进展，miRBase数据库（Release 21： June 2014； http：//www.mirbase.org）中登录注册的植物成熟miRNA已有10 892条，其中绝大多数miRNA来自全基因组序列已知的水稻（713条）、拟南芥（427条）、二穗短柄草（525条）和玉米（321条）等物种。相比之下，小麦染色体组复杂，基因组庞大，全基因组测序虽已完成[1]，但序列组装尚待完成，在miRBase中登录注册的miRNA仅有119条。因此，小麦miRNA研究还需进一步加强。本研究就植物miRNA的生物合成，小麦miRNA的识别、时空表达特性、抗逆相关特性及其功能研究方法进行了总结。

1植物miRNA的生物合成

和动物miRNA不同，大部分植物miRNA基因定位于基因间区域，不成簇聚集[2]，其在基因组上具有一个独立的转录单元，可加工成多条miRNA。miRNA在植物体内的合成较为复杂，需要多种酶和功能蛋白的参与。首先，miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）的作用下转录成一条或多条初级转录产物（primiRNA），随后，与RNA结合蛋白DAWDLE（DDL）结合进入细胞核加工中心（Dbody），在双链RNA酶结合蛋白（HYL1）、Dicer like 1（DCL1）酶、锌脂蛋白（SE）和核酸CAP结合复合体（CBC）的作用下，primiRNA被加工成具有特定二级茎环结构的miRNA 前体（premiRNA）；premiRNA在Hasty（HST）和其他蛋白因子的作用下被转运到细胞质中，在DCL1酶的酶切作用下形成成熟miRNA复合体（Mature RNA duplexes），随后，在HEN1和HYL1等酶的作用下形成成熟的miRNA；成熟miRNA与Argonaute（AGO）蛋白相互作用形成RNA诱导沉默复合物体（RNAinduced silencing complex，RISC），最后与靶基因结合行使其功能[3，4]。

2小麦miRNA研究进展

2.1小麦miRNA的识别

植物miRNA的识别方法主要有直接克隆法、生物信息预测法和高通量测序法三种方法。直接克隆法是先建sRNA库，再测序[5～7]。生物信息预测法是根据miRNA序列在物种间的保守性和miRNA茎环结构的特殊性搜索同源miRNA[7，8]。二代测序技术的发展为miRNA的识别提供了平台，高通量测序技术具有规模大和灵敏度高等优点，是目前植物miRNA识别运用最广泛的一种技术。由于植物体内有较多与miRNA相似的sRNA，在鉴定过程中容易与miRNA混淆。针对这一点，科学家们根据miRNA的特殊二级结构设置了辨别miRNA真伪的标准[9～12]。

植物miRNA的保守性为小麦miRNA的识别提供了方便。2005 年，Zhang等对小麦 EST 数据库进行分析，共获得 16 条小麦 miRNA，分属于9个miRNA家族[13]；Jin等利用基因组的支持向量机程序对小麦EST进行分析，共得到79条候选miRNA[14]。小麦基因组测序及单条染色体的分离和测序，为小麦miRNA的识别提供了更多的资源。Lucas等在小麦1AL染色体上鉴定了42条保守miRNA[15]。2014年，Kurtoglu等利用小麦基因组Shortgun测序结果进行已知miRNA的同源搜索，共得到52条miRNA[16]。高通量测序技术的发展加快了miRNA的识别速度。Yao等[17]和Wei等[18]利用高通量测序技术对小麦sRNA文库进行测序，分别得到了58条和70条miRNA。Li等以小麦7天幼苗为材料，提取RNA进行sRNA测序分析，共得到分属于32个家族的miRNA，并用降解组测序方法验证了这些miRNA的53个靶基因[19]。Chen等对高产小麦Yunong 201及其突变体Yunong 3114分别进行sRNA测序，分别获得924条和1 325条miRNA[20]。

2.2小麦miRNA的时空表达特性

植物miRNA的时空表达特异性分析主要是运用试验手段和高通量分析进行的，其中，试验方法运用较广泛的是Northern blot和RTqPCR。Northern blot能够根据特定miRNA设计探针，进而针对植物不同组织或发育时期进行miRNA的表达模式分析[21]，其缺点是灵敏度较低，很难检测到低丰度的miRNA。RTqPCR以其高灵敏度、低成本和操作简单等优势被广泛应用于miRNA表达模式分析上[22， 23]。Han等以小麦为研究材料，对目前植物应用最广泛的茎环RTqPCR （stemloop RTqPCR）和加A RTqPCR （poly（A） RTqPCR） 方法进行评价，认为poly（A） RTqPCR更适用于小麦miRNA研究[24]。高通量分析方法主要包括miRNA芯片和高通量测序。miRNA芯片可以对不同发育时期、生物和非生物胁迫条件下所有植物的miRNA进行表达模式分析，但是，目前miRNA的探针有限，仅能检测到已知miRNA。高通量测序不仅可以鉴定特定条件下的已知miRNA，还能够同时检测到新miRNA和低丰度miRNA，并将其表达量用reads数来表示，从而揭示其差异表达模式。

Yao和Xin等对鉴定得到的小麦miRNA进行Northern blot表达分析，发现miR502在茎间、根和叶中高表达；miR507和miR509在根中高表达，在茎和茎间中表达量减少，在叶、旗叶和穗中表达量极低；miR513和miR514在根中高表达；miR515只在根和叶中表达；miR2003和miR2004在茎、穗和根中的表达量高于在叶中的表达；miR2001和miR2011在叶和根中表达量高于茎和穗[17， 25]。Meng等通过高通量测序技术在小麦发育期的籽粒中得到605条保守miRNA和268条新miRNA，推测其中的 86条保守miRNA可能参与调控小麦籽粒的灌浆，18条新miRNA可能对小麦籽粒的成熟有重要作用[26]。Han等对小麦五叶期幼苗、孕穗期旗叶以及扬花后5、10、20天的小麦籽粒进行sRNA测序，共得到24条已知miRNA和55条新miRNA。时空表达模式分析发现，已知miRNA中的miR160、miR164、miR166和miR169在籽粒中的表达量高于其他组织/器官，miR156、miR172、miR168、miR396、miR159、miR398、miR1318、miR167在旗叶的表达量高于其他组织/器官；55条新miRNA中的22条在籽粒中表达量高于其他组织（其中有12条只在籽粒中表达），28条在旗叶的表达量高于其他组织/器官[27]。Li等以7、14、21、28天的中国春小麦籽粒为材料，通过sRNA和降解组测序共获得186条保守miRNA和37条新miRNA。进一步分析发现，其中的55个miRNA家族在四个籽粒发育时期表达模式不同，miR408和miR5048的表达量随着籽粒的生长而升高；miR319和miR827在籽粒发育前期表达量逐渐升高，在籽粒发育后期，其表达量又逐渐降低；miR169、miR165和miR444等随着籽粒的生长其表达量逐渐降低[28]。

2.3小麦miRNA与逆境胁迫的关系

miRNA不但与植物的生长发育和花发育相关[29～31]，还与逆境胁迫相关[32]。部分miRNA的靶基因为转录因子，在植物中具有组织特异表达特性[30， 33]。Xin等分析了白粉菌侵染前后和热胁迫前后小麦叶片中miRNA的丰度变化，在鉴定出的153条miRNA中分别有24条和12条miRNA的表达量在白粉病侵染前后、热胁迫前后发生了明显变化[25]。冯浩对苗期感病但成株期抗病的小麦品种兴资9104进行条锈菌接种，研究15条miRNA在不同时间点的表达变化情况，结果发现，它们均能受条锈菌侵染的诱导，并呈现出多种表达趋势，这表明兴资9104的条锈病抗/感性状并不是由某一条或者一类miRNA调控决定的，而是多条miRNA共同调控的结果[34]。

研究发现，拟南芥在生物胁迫和非生物胁迫下，miR393、miR167和miR160表达量均会出现变化[35]。Tang等发现miR167、miR393、miR172、miR396和miR444在小麦受到冷胁迫后，其表达量也发生了明显变化[36]。当小麦受到低温处理时，随着温度的降低，miR165、miR166和miR319的表达量呈现先升后降的趋势，但是，当小麦在同时受到低温和外源ABA胁迫时，miR165和miR166的表达量呈现降升降趋势，miR319呈先降后升的趋势，说明ABA改变了这三条miRNA的表达模式[37]。

2.4小麦miRNA功能研究方法

在植物中，miRNA的功能主要是通过调节其靶mRNA来实现的，调控方式与siRNA（Small interfering RNA）相似，即通过类似于RNA干扰的机制来切割或者是抑制靶基因表达来实现的[7，30，38]。miRNA切割目标mRNA是使与其互补配对区域的某两个核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂[38]，键的断裂主要是由具有核酸内切酶活性的AGO1蛋白介导[39，40]。

植物miRNA还能在转录水平上介导靶标DNA的甲基化。Khraiwesh等对小立碗鲜DCLl基因缺失突变体中的miRNA和其靶mRNA丰度进行研究发现，靶mRNA并未发生切割，但其转录本水平却大幅度降低，其原因是这些突变体积累的miRNA与靶标形成miRNA：靶标mRNA双联体，进而使编码靶mRNA的基因过度甲基化而发生沉默[41]。Wu等也报道了水稻中一类由DCL3切割产生的长度为24 nt的新miRNA（long miRNA，简写为lmiRNA）。该项研究证实了lmiRNA可以依据其产生机制和5′末端核苷酸选择结合AGO4蛋白，然后招募重新甲基转移酶DRM2甲基化其邻近的靶基因，从而在转录水平上进行基因的表达调控[42]。

2.4.1小麦miRNA功能研究方法基因功能的研究一般采用基因的过表达或者干扰（抑制、敲除）的方法进行，miRNA的功能研究也不例外，但是，miRNA行使功能的只是21 bp长度的成熟miRNA，不同于其它功能基因。利用转基因手段转化miRNA的前体序列是研究其功能最常用的方法之一[43， 44]。借助病毒载体瞬时过表达miRNA是近年来发展起来研究其功能的方法。Feng等用含有小麦miR159前体的大麦条斑花叶病毒（BSMV）侵染小麦，然后，利用Northern blot对其进行分析，结果发现，小麦体内miR159含量明显高于只接种BSMV的小麦植株，认为miRNA表达量的增加是由病毒携带的miR159前体通过siRNA切割方式形成的[45]。韩冉利用同样方法在小麦中瞬时过表达了miR156，发现miR156的增加可导致小麦抽穗时间延迟[46]。

STTM（Short tandem target mimic）短串联靶标类似物，是人工合成的一段短的目标重复序列，两端为目标miRNA结合位点。该序列能结合目标 miRNA，从而能有效阻止miRNA与目的基因的结合，导致目的基因的积累，是研究目标miRNA功能的重要介质[47～49]。目前，已有利用STTM技术研究小麦miRNA功能的报道。Jiao等将含有miR159和miR3134a的STTM分别连接到BSMV载体上，然后分别侵染小麦，结果发现，miR159和miR3134a的表达量较对照均明显减少[50]。

2.4.2小麦miRNA功能研究由于小麦miRNA研究起步较晚，目前对其研究还处于鉴定、功能预测和功能相关性研究上。目前，小麦miRNA功能研究主要是通过对靶基因的功能预测来实现的。Yao等通过搜索小麦EST数据库，在232条小麦miRNA中共检测得到189条靶基因，并指出在小麦和其它植物中保守的miRNA，其靶基因序列也比较保守，这些靶基因涉及到部分转录因子，其功能主要是调控植物的生长发育和参与逆境胁迫；对于小麦特有的miRNA，其靶基因主要参与细胞代谢和生物非生物胁迫[51]。

3展望

综上所述，虽然小麦miRNA研究起步较晚，miRBase数据库中注册的小麦miRNA数量较少，但是，近年来小麦miRNA的预测与鉴定研究进展很快。目前，已鉴定出的小麦miRNA有1 500多条，miRNA功能研究方法也逐渐完善。相信随着小麦全基因组组装的完成以及生物信息学等新技术的发展，小麦 miRNA 的研究会更为全面和深入。

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