基于第二代测序的大鳞副泥鳅生长相关SNP标记的开发

葛辰等

摘要：大鳞副泥鳅是鳅科重要经济鱼类，通过Illumina HiSeq 2000测序平台对2个大鳞副泥鳅样本的转录本进行了高通量测序，其中AB2011M-1是群体中生长较快的10尾鱼的混合转录本，AB2011M-2是生长较慢的10尾鱼的混合转录本。通过对以上2个混合转录本的测序，分别获得了65 536和80 786个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）突变；对2个测序样本进行表达差异的比较，获得了39个表达差异基因。随机选取120个位点设计引物，进行验证分析，共获得16个有效的多态性标记。

关键词：大鳞副泥鳅；高通量测序；SNP；多态性标记；引物设计

中图分类号： S917.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0021-07

主要从事鱼类遗传育种与保护生物学研究。E-mail：lingqf@suda.edu.cn。大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）属鲤形目鳅科花鳅亚科副泥鳅属，别称板鳅、黄板鳅，是一种底栖杂食性淡水鱼类，主要分布于东亚地区。大鳞副泥鳅的肉质鲜美、营养丰富[1]，近几年来，其市场需求量不断增大，已成为我国重要的水产养殖物种[2]。

育种是应用各种遗传学方法，改造生物的遗传结构，实现培育出高产优质品种的目标[3]。通过传统育种方法获得一个新品种需要经过5代以上人工选择[4]，因此，利用传统的育种方法获得优良品系需要投入大量的时间、人工和资源；且育种操作多凭经验来控制选择手段，影响因素较多，不能快速满足当前渔业发展对水产良种的需要。

随着分子生物学的发展，分子标记辅助育种（molecular assisted selection，MAS）技术已日趋成熟。最早应用于MAS育种的分子标记有限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、随机扩增多态 DNA （random amplified polymorphic DNA，RAPD）[5]、扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）[6]等标记方法。近年来，简单重复序列（Simple Sequence Repeat，SSR）和单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）也被应用于MAS育种[6-7]。其中，SNP作为新兴的分子标记，拥有数目多、分布广、遗传稳定等优点而广泛受到关注。

筛选未知或已知SNP的方法有等位基因特异寡核苷酸片段分析（allele-specific oligonucleotide，ASO）[8]、基因芯片技术（gene chips）[9]、探针技术（TaqMan）[10]、AFLP[11]、变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、单链构想多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）[12]、直接测序等方法。这些方法各有所长，在不同的分析领域得到了广泛的应用。其中，最快捷、开发量最大的是高通量测序方法，该方法通过不同个体的同一DNA片段的直接测序以及序列比对，使SNP突变的检出率可达100%，且可以直接得到突变碱基的类型及其准确位置等 SNPs 分型的参数[13-14]。

在水产动物中，鲤[15]、草鱼[16]、大口黑鲈[17]、栉孔扇贝[18]等均已有SNP的研究报道，但迄今为止，尚未见到通过高通量测序批量开发大鳞副泥鳅SNP的研究报道。本研究旨在开发与生长差异相关的多态性SNP标记，为大鳞副泥鳅的分子育种奠定理论基础和实践方法。

1材料与方法

1.1试验材料

2011年，以400组洪泽湖野生大鳞副泥鳅为亲本，进行人工繁殖，获得1个混合选育群体。2012年10月，随机采样200尾子代，测量体宽、体长、全长、周长、体厚和体重等性状指标，然后选取生长显著快速的10尾鱼[体质量（11.02±103） g]和显著缓慢的10尾鱼[体质量（2.25±0.36） g]，分别标志为混合样本AB2011M-1和AB2011M-2。分别提取以上2组试验鱼的肌肉组织，于RNA样本保存液 （D311A，TaKaRa） 中4 ℃保存备用。

1.2RNA的提取与转录组文库构建

用TRIzol 试剂对样本肌肉组织提取总RNA，等量混合成快、慢2个转录组测序样本。对cDNA库进行片段长度的筛选，进行PCR扩增（使用Phusion DNA聚合酶，共15个循环），扩增产物由2%琼脂糖电泳检测，回收300～500 bp的cDNA片段。

1.3转录组测序与组装

通过TBS-380微型荧光计的定量化测定，具有双末端的cDNA片段在Illumina HiSeq 2000 （读长长度为2×100 bp）平台上进行测序。

使用SeqPre（https：//github.com/jstjohn/SeqPrep） 和condetri_v2.0.pl （http：//code.google.com/p/condetri/downloads/detail？name=condetri_v2.0.pl ）软件进行序列除杂。用Trinity软件对去杂后片段进行序列组装和拼接（http：//trinityrnaseq.sourceforge.net/）。

1.4转录本基因注释

使用蛋白质非冗余数据库（NR数据库）中的的BlastX程序进行转录本的比对，E值的设定为小于1.0×10-5[19]。比对获得的序列使用Blast 2 GO软件进行GO（gene ontology）注释[20]，GO分类使用in-house perl scripts[21]；然后使用软件blastx/blastp 2.2.24+对序列进行KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析。

1.5SNP分析

将拼接好的序列作为对比模板，通过软件Samtools （http：//samtools.sourceforge.net/）和VarScan v.2.2.7（http：//varscan.sourceforge.net/）将从AB2011M-1和AB2011M-2中获得的序列信息分别与模板进行对比，得到候选SNP的信息。根据分析结果，选取差异基因所含的SNP，设计引物进行验证。用Primer 5.0软件设计引物，引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。PCR扩增的反应体系为 20 μL，包含1 μL DNA模板，10 μL 2× PCR Mix（CW2296，世纪康为），上下游引物各1 μL，7μL H2O。PCR反应循环流程为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，25个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物首先通过2%琼脂糖电泳进行初步筛选，具有清晰条带的标记再通过6%聚丙烯凝胶电泳进行基因分型。在进行聚丙烯凝胶电泳前，用SSCP变性剂对产物进行95 ℃变性10 min，并立即冰浴处理。SSCP变性剂配方包括49 mL去离子甲酰胺、1 mL 0.5 mol/L EDTA（pH值8.0）、0.1 g溴酚蓝、0.1 g二甲苯青FF。DNA分子质量标记采用Takara公司的DL-1 000 DNA marker。

2结果与分析

2.1数据的筛选、拼接与注释

3讨论与结论

3.1测序结果注释

在本研究中，58.56%的序列预测到ORFs，60.98%的序列在NR数据库中得到注释，注释到的基因参与了大鳞副泥鳅的代谢和其他生物过程，没有被注释到的基因可能是此物种的特异基因，需要通过进一步的研究将这些特异基因扩充至各个数据库中，以丰富数据库的内容。

3.2SNP的开发

本研究通过第二代测序技术在2个样本中分别获得 65 536 和80 786个SNP。由于是对转录本进行测序，因此，这些SNP又称为cSNP。cSNP在转录区域形成的频率远低于非转录区[22]，在生物进化中这是为了保护物种的稳定性，转录区发生的非同义SNP突变可能会在进化过程中被淘汰，达到保护的目的[23]。cSNP与相关性状有重要的联系，因此，cSNP 往往具有重要的研究价值，可以为进一步的相关性状关联、代谢通路、遗传作图研究提供有效的工具，为分子育种奠定基础。

SNP突变形式有转换（C/T，G/A）和颠换（C/A，G/T，C/G，A/T），研究表明转换出现的频率约为颠换频率的2倍[24]。本研究中，转换/颠换为1.39，和Manuel等人对比目鱼 EST-SNP 研究结果相近（1.408）[25]，与鲑鱼[26]、乌颊鱼[27]和斑马鱼[28]的EST-SNP研究结果（1.885）有一定差距，表明了不同生物在进化过程中承受着不同的进化压力[22]。

3.3SNP的验证

SNP是单个碱基引起的突变，在检测中可能会造成假阳性，影响试验的准确性[25-26]，因此，采取32个个体重复2次SSCP检测，以消除假阳性干扰。本研究SNP验证率（239%）较预期（50%）低，可能是由于使用的扩增模板是DNA，其中的内含子会同时被扩增出来。内含子也可能存在SNP的干扰，造成扩增片段长度过大、扩增条带多而杂，降低了在聚丙烯凝胶电泳中的分辨率[29]，由此造成某些具有多态的SNP无法被鉴定。

参考文献：

[1]Cho Y S，Kim B S，Kim D S，et al. Modulation of warm-temperature-acclimation-associated 65-kDa protein genes （Wap65-1 and Wap65-2） in mud loach （Misgurnus mizolepis，Cypriniformes） liver in response to different stimulatory treatments[J]. Fish & Shellfish Immunology，2012，32（5）：662-669.

[2]倪勇，伍汉霖. 江苏鱼类志[M]. 北京：中国农业出版社，2006：391.

[3]楼允东. 鱼类育种学[M]. 北京：中国农业出版社，2001.

[4]孙效文. 鱼类分子育种学[M]. 北京：海洋出版社，2010.

[5]Jackson T R，Ferguson M M，Danzmann R G，et al.Identification of two QTL influencing upper temperature tolerance in three rainbowtrout （Oncorhynchus mykiss） half-sib familie[J]. Heredity，1998，80：143-151.

[6]Robison B D，Wheeler P A，Sundin K，et al. Composite interval mapping reveals a major locus influencing embryonic development rate in rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）[J]. The Journal of Heredity，2001，92（1）：16-22.

[7]Kocher T D，Lee W J，Sobolewska H，et al. A genetic linkage map of a cichlid fish，the tilapia（Oreochromis niloticus）[J]. Genetics，1998，148（3）：1225-1232.