大白菜光周期调控因子CCA1的差异分析及功能标记开发

张志刚 刘栓桃 李巧云 王晓 王立华 赵智中 王淑芬 徐文玲 刘贤娴 刘辰

摘要：本研究利用春季和秋季条件下光周期的变化趋势，对两个大白菜自交系06-247与He102的光周期敏感性进行了鉴定，结果是06-247对长日照敏感，而He102对长日照不敏感。采用同源克隆技术，比较分析两材料光周期响应关键调控因子CCA1的全长cDNA序列，发现二者编码区存在两处6 bp插入/缺失和14处非同义SNPs差异；二者编码产物分别包含552、556个氨基酸残基；其非同义SNPs造成不同氨基酸的替换；二者间氨基酸序列差异主要位于CCA1蛋白中间区域的蛋白-蛋白相互作用结构域和C端的磷酸化修饰结构域。本研究开发出区分两处6 bp插入/缺失的共显性分子标记。该结果为深入研究CCA1在大白菜光周期响应调节过程中的功能奠定了基础。

关键词：大白菜； 依赖/不依赖长日照开花型；BraCCA1；插入/缺失突变；功能标记

中图分类号：S634.103.6文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）06-0001-06

对春白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis） 而言，耐抽薹是一个至关重要的指标。抽薹之后必然伴随开花，因此抽薹属于大白菜开花途径的一个发育过程。大白菜与模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）同属十字花科（Cruciferae）芸薹属（Brassica），因此有关拟南芥开花途径的分子机制研究结果对大白菜相关研究有较大借鉴价值。对拟南芥开花途径的分子机制研究表明，植物的开花受四条途径控制，即春化途径、光周期途径、自主途径和赤霉素途径[1]。大白菜属于两年生长日照植物，在长期进化过程中，适应了当年秋季结球、次年春季抽薹开花的特性，因此它由营养生长向生殖生长的转变除了需要明显的环境低温外，还需要相对较长的日照，即春化和长日照是诱导大白菜开花的主要环境因子[2]。在春白菜生产实践中，春季温度波幅较大，且常有倒春寒的影响，春化难以避免，而日照长度的变化则随着时间的推移呈现恒定的变化趋势，是变化稳定的环境因子。所以选出的长日照依赖型晚抽薹比耐低温晚抽薹的大白菜材料在生产上表现更稳定，有望创制出更耐抽薹的大白菜种质。

抽薹开花的光周期调控途径涉及复杂的昼夜节律钟调控网络，昼夜节律钟核心震荡子包括 CCA1 和 LHY 两个MYB类转录因子，二者同源性较高，以同源或者异源二聚体结合于目的基因启动子区的相应元件发挥作用[3]。CCA1和LHY单基因功能缺失突变体都有短日照下早抽薹开花的表型，可以缩短光周期2～3 h[4]。拟南芥中的CCA1包含663个氨基酸残基，N端第11～82位氨基酸残基是MYB结构域，负责与启动子元件结合[5]；第136～316位氨基酸残基与蛋白二聚化有关，负责蛋白-蛋白相互作用；C端是磷酸化调节区，其中的丝氨酸残基是潜在的磷酸化修饰位点[6]。凡是能够影响上述关键功能域结构的氨基酸突变都有可能影响CCA1的功能，从而影响其介导的光周期开花响应。研究者分别从杨树、大麦、玉米[7～9]等植物中克隆出相应的CCA1，分子进化关系表明，它们在单双子叶植物间非常保守，其N端的核酸结合结构域的氨基酸序列相似度高达79%以上，而鲜见同一物种中基因多样性的报道。本研究从不同光周期依赖型大白菜材料中分别克隆了CCA1全长cDNA，发现二者编码区存在两处插入/缺失突变，利用生物信息学技术对其氨基酸序列进行分析，开发出区分这两处插入/缺失突变的共显性标记，旨在为利用CCA1基因突变培育耐抽薹春白菜提供理论依据和可供选择的标记。

1材料与方法

1.1试验材料

耐抽薹大白菜自交系06-247是市售日本春白菜F1的自交分离系，易抽薹大白菜自交系He102是我国地方品种“河南二包头”的自交分离系。

1.2试验方法

1.2.1光周期敏感试验试验于2010年至2013年在山东省农业科学院蔬菜花卉研究所核心试验基地进行，常规管理。试验一（长日照）：2010年8月10日正常播种，田间常规管理，11月21日采收健康母株，11月30日定植于日光温室；试验二（长日照）：2012年12月28日催芽育苗，2013年3月7日定植于纱棚；试验三（短日照）：2013年6月采收的饱满种子，浸种催芽后将萌动的种子置于4℃冰箱春化处理35天，8月20日播种于含营养土（基肥∶壤土∶蛭石=1∶1∶1）的花盆内。每材料播种5～10株。所有试验常规肥水管理，随时观察长势，记录现蕾期、始花期，薹高（短缩茎长）的调查与测量参照余洋俊[10]和张德双[11]等的方法，取平均值，以厘米（cm）为单位，并用DPS软件进行显著性检验。

1.2.2CCA1的全长cDNA克隆及序列分析大白菜幼苗长至二叶一心期时，取真叶组织约1 g立即置液氮中研磨、Trizol （Invitrogen Cat. No. 15596-026）法提取总RNA并反转录合成cDNA第一链 （天根试剂盒KR104并按说明书操作）。用Primer Premier 5.0软件根据BRAD数据库中CCA1的参考序列设计基因特异性引物（pF1：5′-TCGAGTGGTTCTAGTTTCTCAATCG-3′，pR1：5′-AAGACTATGGACAAAATACACAGGC-3′），以cDNA为模板用高保真Taq酶进行PCR扩增。PCR反应体系：5×HF Buffer 10 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L） 4 μL，引物（10 μmol/L，下同） pF1 1 μL，引物 pR1 1 μL，全式金高保真酶 （北京全式金TransStart FastPfu DNA Polymerase，AP221-01） 1 μL，模板1 μL，ddH2O 32 μL。PCR 反应程序：95℃预变性 2 min；95℃变性 20 s，60℃退火 20 s，72℃延伸 90 s，循环 35 次；72℃后延伸 5 min。用 1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，确认有特异性目的条带后取1 μL PCR产物和1 μL平端载体（北京全式金pEasy-Blunt，CB101-01）于室温（25℃）进行15 min的连接反应。热激法转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞（北京全式金，CD501-01），菌落PCR检测阳性克隆，取阳性克隆送北京华大基因有限公司进行测序验证。序列分析采用DNAMAN软件进行。

1.2.3功能标记开发及应用针对两材料中CCA1编码区两处InDels差异，在其两端分别设计特异引物进行PCR扩增，引物序列为PF1： 5′-CTAAAGGTGTACCAGTGGCTCAA-3′，PR1：5′-CAAGGGACTCTTTTCCATCATTC-3′；PF2：5′-TTTACATATAAGAGAGAGGAGGGTCA-3′，PR2：5′-TACTTAATAGCTGCTGCTTTGAAGC-3′。扩增产物用6.0%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、银染照相。用开发的标记检测部分大白菜材料，验证标记的实用性。

2结果与分析

2.1光周期敏感性鉴定

光周期敏感性调查结果见表1。由试验一和试验二可知，He102与06-247在春分节气前（短日照条件下）都可以正常现蕾，表明春分前的低温足以使二者通过春化，但06-247现蕾时间明显晚于He102。二者始花期出现的时间亦显著不同，试验一中He102始花期介于2月中旬，此时花薹长达23 cm左右，表明He102在短日照条件下可以正常抽薹开花，也说明该材料抽薹开花不依赖长日照；06-247则不然，其始花期在春分以后的3月下旬，且此时花薹极短，二者始花期薹高差异极显著。另外，从试验一的田间观察发现，06-247始花期时花粉极少，人工辅助授粉难以结荚，说明日照相对较短时花粉生活力较差，要等到4月中下旬，日照时数接近14 h时其花粉才能发育正常。由此可见，06-247抽薹开花依赖于长日照。试验三的结果进一步表明，短日照条件下（9月下旬秋分后），He102在通过春化后可以正常抽薹开花，而06-247虽然可以分化花芽，但始终没有抽薹，花蕾也不能开放，甚至出现结球现象。综上所述，He102的现蕾、抽薹和开花均不依赖长日照，06-247的现蕾对长日照依赖性不强、而抽薹和开花则必须在长日照下才能进行。由此推断，大白菜的花芽分化（现蕾）与抽薹开花可能受不同的基因控制，属于不同的农艺性状。利用自然日照长短的变化，将试验一/二与试验三结合，可以有效鉴定大白菜抽薹开花对长日照的依赖性。

2.2CCA1全长cDNA克隆及氨基酸序列分析

CCA1是模式植物拟南芥中调控光周期的关键转录因子，因此本研究采用同源克隆技术克隆了两材料中CCA1全长cDNA，PCR扩增结果如图1所示。经测序验证，发现长日照依赖型耐抽薹材料06-247的CCA1编码区长1 659 bp，与BRAD数据库中Chifu-401的序列完全同源，而来自长日照不依赖型极易抽薹材料He102的CCA1编码区长1 671 bp。后者除了比前者多两处6 bp的插入外，整个编码区还有23处SNPs（图2A），其中14处是非同义突变，造成不同氨基酸的替换突变（图2B）。经预测，前者编码产物包含552个氨基酸残基，后者包含556个，二者分子量分别是60.14 kD和60.58 kD。

图206-247与He102的CCA1编码区序列（A）及氨基酸序列（B）比较依据全长cDNA推导的氨基酸序列差异见表2。在两材料CCA1全长cDNA之间的两处6 bp插入/缺失中，第一处是t.329_330 ins CGGAAG，使He102的CCA1 蛋白第112位后的氨基酸插入Gly和Ser两个残基；第二处是t.1407_1408 ins CAACAA，导致He102的CCA1在469位氨基酸之后插入两个Gln （图2B）。其余非同义突变造成不同氨基酸的替换，其中性质差异较大的有118 Pro>Thr、119 Gly>Cys、125 Glu>Gln、176 Asn>Lys、440 Ser>Ala、442 Ser>Ala、465 Lys>Gln、467 Glu>Lys。另外，440 Ser>Ala、442 Ser>Ala、528 Ser>Asn、529 Asn>Ser与丝氨酸的替换有关，是潜在的磷酸化修饰位点。

根据拟南芥CCA1的结构域分布特点，He102中的突变位点主要位于第113位氨基酸之后，主要在蛋白-蛋白相互作用区和磷酸化修饰区。上述性质差异较大的氨基酸替换突变，位于蛋白-蛋白相互作用结构域的有可能影响CCA1的空间折叠结构，而位于C端与丝氨酸有关的四处突变可能影响磷酸化修饰位点。

2.3基于小片段插入缺失的共显性标记开发

06-247与He102的CCA1编码区两处小片段插入/缺失大小仅为6 bp，一处靠近5′端，另一处靠近3′端。在突变区域两侧保守区设计引物，使扩增片段介于100～200 bp间，用6.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳对扩增片段进行检测，结果见图3A，表明6.0%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳能够很好地区分6 bp的差异。用其中位于3′端的标记检测了部分大白菜资源（图3B），从图中可以看出，所开发的标记扩增条带清晰、没有杂带干扰，适合用于种质资源的基因型筛查。

3讨论与结论

耐抽薹大白菜种质的创新是春白菜育种的关键，而耐抽薹性状的正确评价及有效筛选直接关系到耐抽薹种质的创新效率。大白菜耐抽薹性状的评价方法较多，大都采用不同的低温春化处理，根据处理一定时间后材料的现蕾和开花早晚来判断其耐抽薹性，且一般将现蕾期、始花期和始花期薹长共同作为判定耐抽薹的标准[10，11]。这在一定程度上增加了耐抽薹性状QTL定位研究的复杂性，难以得到精细的定位结果。如张磊[12]利用类似的耐抽薹鉴定方法定位了9个与耐抽薹有关的QTLs，于拴仓[13]则定位了6个。有的研究者虽然注意到光周期对一些大白菜抽薹开花有影响，也发现现蕾和抽薹不一致[14，15]，但并未提出长日照依赖型抽薹开花的概念，仍将现蕾、抽薹、开花综合作为耐抽薹性状。本研究首次发现06-247与He102现蕾和抽薹是两个独立的性状，为下一步耐抽薹性状精细解析和精准定位奠定了基础。本研究试验二和试验三相结合，可以有效判定大白菜材料的抽薹开花是否依赖长日照，为长日照依赖型表型鉴定提供了新的方法。

自然界日照长短是恒定变化的环境因子，植物为了响应光周期的变化，进化出复杂的调控机制。本研究基于模式植物拟南芥光周期诱导开花的调控机制，从光周期关键调控因子CCA1着手，发现06-247与He102的CCA1在蛋白-蛋白结合区和磷酸化修饰区存在氨基酸插入/缺失和替换突变。这可能导致两者CCA1蛋白功能的差异，从而导致两材料对光周期敏感程度不同，即CCA1是潜在的光周期调控关键功能基因。基于编码区小片段插入/缺失的差异，本研究开发出区分两个大白菜品种的共显性分子标记，该标记位于功能基因内部，是潜在的功能标记，为下一步耐抽薹种质筛选、耐抽薹大白菜新品种辅助育种及耐抽薹性状精细定位研究提供了可供选择的标记。

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