银翘口服液质量标准研究

赵增成 林树乾 李桂明 黄中利 傅剑 冯敏燕 宋敏训

摘要：为了建立银翘口服液的质量标准，采用薄层色谱法（TLC）对处方中的金银花、连翘、牛蒡子、薄荷、荆芥进行了定性鉴别，并采用高效液相色谱法（HPLC）对牛蒡苷含量进行测定。结果显示，TLC色谱斑点清晰、专属性强、阴性对照无干扰；在0.0622～0.6220 mg/mL范围内，牛蒡苷浓度与峰面积呈良好的线性关系，平均加样回收率为102.4%，RSD为2.2%，样品中牛蒡苷的平均含量为6.7246 mg/mL。本研究所建立的检测方法简便、准确、专属性强、重复性好，可对银翘口服液的质量进行有效控制。

关键词：银翘口服液；薄层色谱；高效液相色谱；质量标准

中图分类号：S859.79文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）06-0124-06

银翘口服液是本课题组研发的新兽药，处方源于《温病条辨》之“银翘散”，由金银花、连翘、薄荷、荆芥、淡豆豉、桔梗、淡竹叶、甘草等组成，功效为辛凉解表、清热解毒，主治外感风热或温病初起[1～4]。为了制定银翘口服液的质量标准，本研究采用薄层色谱法对制剂中金银花、连翘、薄荷、荆芥、牛蒡子进行了鉴别研究，以组方中牛蒡子的主要有效成分牛蒡苷为指标成分，采用高效液相色谱法对其含量进行了测定。

1材料与方法

1.1药品与试剂

金银花对照药材（批号121060-201107）、绿原酸对照品（批号110753-201114）、连翘对照药材（批号120908-201016）、连翘苷对照品（批号110821-201110）、薄荷对照药材（批号120916-201109）、薄荷脑对照品（批号110728-201006）、荆芥对照药材（批号120911-201110）、牛蒡子对照药材（批号120903-201109）、牛蒡苷对照品（批号110819-201108），均购置于中国食品药品检定研究院。银翘口服液，由山东昊泰科技药业有限公司试制。乙睛为色谱纯试剂，甲醇、甲酸、异丙醇、三氯甲烷、磷酸等均为分析纯试剂。

1.2试验仪器

安捷伦高效液相色谱仪，AB265-S型双量程电子天平，KQ5200DB型超声仪，硅胶G板（青岛海洋化工厂），聚酰胺薄膜（青岛海洋化工厂）。

1.3试验方法

1.3.1薄层鉴别①金银花的薄层鉴别。取绿原酸对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液作为对照品溶液。再取金银花对照药材0.2 g，加甲醇5 mL，放置12 h，过滤，取滤液作为对照药材溶液。另取银翘口服液10 mL，加甲醇10 mL，超声处理30 min，3 500 r/min离心30 min，取上清液水浴蒸干，用甲醇2 mL溶解，放置后取上清液作为供试品溶液。取不含金银花的银翘口服液同法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验[5]，吸取以上溶液各2 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以异丙醇-甲醇-甲酸（9∶1∶0.5）的溶液为展开剂，展开，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。

②连翘的薄层鉴别。取连翘苷对照品，加甲醇制成每1 mL含0.25 mg的溶液，作为对照品溶液。另取连翘对照药材1 g，加石油醚（30～60℃）20 mL，超声处理15 min，过滤，弃去石油醚液，残渣挥干石油醚，加甲醇20 mL，密塞，超声处理20 min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇5 mL溶解，作为对照药材溶液。取银翘口服液30 mL，加甲醇60 mL，超声处理30 min，3 500 r/min离心30 min后取上清液蒸干，用2 mL甲醇溶解，放置后取上清液作为供试品溶液。同法将不含连翘的银翘口服液制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取连翘苷对照品溶液15 μL，连翘对照药材溶液20 μL，供试品溶液和阴性对照品溶液各30 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇（8∶1.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

③牛蒡子的薄层鉴别。取牛蒡苷对照品，加甲醇制成每1 mL含5 mg的溶液，作为对照品溶液。另取牛蒡子对照药材0.5 g，加甲醇20 mL，超声处理30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加乙醇2 mL溶解，作为对照药材溶液。取银翘口服液10 mL，加甲醇20 mL，超声处理30 min，3 500 r/min离心30 min后取上清液蒸干，用2 mL甲醇溶解，放置后取上清液作为供试品溶液。取不含牛蒡子的银翘口服液同法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取对照品溶液、对照药材溶液各5 μL，吸取供试品溶液、阴性对照液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（40∶8∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。

④荆芥的薄层鉴别。取荆芥对照药材0.8 g，加石油醚（60～90℃）20 mL，密塞，时时振摇，放置过夜，过滤，滤液挥至1 mL，作为对照药材溶液。取银翘口服液10 mL，加石油醚（60～90℃）20 mL，超声处理30 min，置分液漏斗中，静置后取石油醚层，水浴蒸干，放冷后，用2 mL石油醚（60～90℃）溶解，作为供试品溶液。取不含荆芥的银翘口服液同法制成阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10 μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（17∶3）为展开剂展开，取出晾干，喷以5%香草醛的5%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。

⑤薄荷的薄层鉴别。取薄荷脑对照品，加石油醚（60～90℃）制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。另取薄荷对照药材0.5 g，加石油醚（60～90℃） 5 mL，密塞，振摇数分钟，放置30 min，过滤，滤液挥至1 mL，作为对照药材溶液。再取银翘口服液10 mL，加20 mL石油醚（60～90℃），超声处理30 min，置分液漏斗中静置数分钟后取石油醚层，水浴蒸干，用2 mL石油醚（60～90℃）溶解，作为供试品溶液。用去除薄荷的银翘口服液同法制取阴性对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取以上各种溶液5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯（19∶1）为展开剂展开，取出晾干，喷以香草醛硫酸试液-乙醇（1∶4）的混合溶液，100℃加热至斑点显色清晰。

1.3.2高效液相色谱法测定牛蒡苷含量 ①色谱条件。在对影响指标成分牛蒡苷分离度和响应值的主要因素（包括色谱柱、柱温等）进行考察和优化的基础上，最终确定色谱条件为：Agilent XDB-C18色谱柱，柱温25℃，流速1 mL/min，进样量5 μL，乙腈-0.4%磷酸溶液（25∶75）为流动相，检测波长为277 nm。

②对照品、供试品溶液及阴性对照品溶液的制备。牛蒡苷对照品溶液的制备：精密称取牛蒡苷对照品，加甲醇制成浓度为0.3110 mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取银翘口服液5 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇15 mL，超声30 min，加甲醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。

阴性对照品溶液的制备：按处方制备工艺制成去除牛蒡子的阴性对照样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

③系统适应性试验。分别吸取牛蒡苷对照品、供试品溶液及阴性对照品溶液各5 μL，按以上所建立的色谱条件进行测定，记录色谱图。

④标准曲线制备。取牛蒡苷对照品用50%甲醇分别配制成0.0622、0.1244、0.1866、0.3110、0.4354、0.6220 mg/mL 6个浓度，按建立的色谱条件依次进样，记录色谱图与峰面积，以峰面积对牛蒡苷的浓度进行线性回归。

⑤精密度试验。将对照品溶液进样5 μL，重复进样测定6次，记录色谱图与峰面积，考察仪器的测定结果重现性。

⑥重复性试验。将同一批号的样品，按供试品溶液制备方法，平行制备成6份供试品溶液，按建立的色谱条件分别进行测定，记录色谱图与峰面积。

⑦稳定性试验。吸取供试品溶液，按建立的色谱条件分别于0、2、4、6、8、12 h进行试验测定，记录色谱图与峰面积。

⑧加样回收率试验。平行精密量取配制好的供试品溶液1 mL（牛蒡苷含量0.6725 mg/mL），共6份，分别置50 mL量瓶中，分别加入0.3110 mg/mL对照品溶液2 mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。按照建立的色谱条件进行试验，记录色谱图及峰面积。以峰面积计算，测定牛蒡苷含量，计算回收率。

回收率（%）=（测得牛蒡苷的量-制剂中牛蒡苷原有量）/加入牛蒡苷对照品的量×100

⑨样品牛蒡苷含量测定。选取10批样品，按照建立的色谱条件进行试验，记录色谱图和峰面积，计算出样品中牛蒡苷的含量。

2结果与分析

2.1薄层鉴别结果

2.1.1金银花的薄层鉴别由图1可知，供试品色谱中，在与对照品绿原酸色谱和金银花对照药材色谱相应的位置上有显相同颜色的荧光斑点，阴性对照液色谱中无相应荧光斑点。

2.1.2连翘的薄层鉴别由图2可知，供试品色谱中，在与对照品连翘苷色谱和连翘对照药材色谱相应的位置上有显相同颜色的斑点，阴性对照液色谱中无相应斑点。

2.1.3牛蒡子的薄层鉴别由图3可知，供试品色谱中，在与对照品牛蒡苷色谱和对照药材色谱相应的位置上有显相同颜色的斑点，阴性对照液色谱中无相应斑点。

2.1.4荆芥的薄层鉴别由图4可知，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上有显相同颜色的斑点，阴性对照液色谱中无相应斑点。

2.1.5薄荷的薄层鉴别由图5可知，供试品色谱中，在与薄荷脑对照品色谱和对照药材色谱相应的位置上有显相同颜色的斑点，阴性对照液色谱中无相应的斑点。

2.2牛蒡苷含量测定结果

2.2.1系统适应性试验图6显示，银翘口服液样品色谱图中，在与牛蒡苷对照品色谱图的相应位置上有相同保留时间的色谱峰，在此保留时间，阴性对照液无色谱峰出现。样品色谱中牛蒡苷峰与相邻峰分离良好，阴性对照溶液中所含成分对牛蒡苷测定无干扰作用。

2.2.2牛蒡苷线性关系考察不同浓度的对照品溶液峰面积结果见表1。

以牛蒡苷浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制牛蒡苷标准曲线，见图7。将表1中的数据进行线性回归，得到线性回归方程：y=2684.3x-0.3691（R2=1.0000）。结果表明，牛蒡苷进样量在0.0622～0.6220 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2.3精密度试验结果见表2，RSD为0.27%，表明本方法精密度良好。

2.2.5稳定性试验结果见表4，RSD为1.85%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.2.6加样回收率试验结果见表5，平均回收率为102.4%，RSD为2.2%，表明该方法准确可信。

2.2.7样品牛蒡苷含量测定10批样品的含量测定结果见表6，牛蒡苷平均含量为6.7246 mg/mL。

3讨论

3.1薄层色谱法（TLC）是一种快速、灵敏、高效地分离和定性分析微量物质的方法，因其设备简单、操作方便、专属性好、分析速度快等特点，已成为中药质量控制的主要手段之一[6，7]。本研究对新研发的银翘口服液中每味中药的有效成分进行薄层定性鉴别，目的是检出其药味成分。经过反复测定，发现口服液中金银花、连翘、牛蒡子、薄荷、荆芥有效成分在薄层鉴别中色谱明显、重复性好、专属性强、无干扰，说明该方法可快速确定银翘口服液中以上五味中药的存在，因此可将其用于银翘口服液质量标准草案鉴别项。

3.2影响薄层鉴别的因素较多，主要包括样品处理、薄层板、点样量、展开剂、显色剂等，可直接影响到色谱图中斑点分离度、清晰度和重现性[8]。如点样量太小，斑点不清晰；点样量太多，展开剂不能全部负载，容易产生脱尾现象。供试液中杂质成分较多，由于相互干扰或背景污染难以得到满意的分离效果。对于难以分离的相邻物质，根据它们的理化性质，选用极性大小适宜的溶剂并做好配比则最为关键[9，10]。本试验分别对样品处理、薄层板、点样量、展开剂、显色剂等影响薄层色谱的因素进行了反复筛选和优化，最终确定了最佳的薄层色谱条件。

3.3处方中牛蒡子疏散风热、解毒利咽，其主要活性成分牛蒡苷是重要的生物活性物质，具有抗菌、抗病毒等作用，其分子式、结构式明确，因此将牛蒡苷确定为本品含量测定的指标成分。本研究所建立的高效液相色谱含量测定方法精确性、稳定性、重复性良好，可快速准确地测定出牛蒡苷的含量。上述鉴别和含量测定方法可用于银翘口服液质量标准和制剂质量的有效检测和控制。

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