APP下载

微波辅助复合酶提取锦灯笼皮果胶的工艺优化

2016-05-14张超王英臣

农业与技术 2016年7期
关键词:提取果胶微波

张超 王英臣

摘 要:以吉林地区的锦灯笼皮为原料,利用微波辅助复合酶法对锦灯笼皮中果胶进行工艺优化研究。研究了微波辐射时间、加酶比例(m半纤维素:m纤维素)、复合酶用量(m半纤维素:m纤维素=1:1)、微波功率、料液比、酶解温度、pH值、酶解时间对果胶提取的影响。采用Box-Behnken Design 响应面优化得到最佳工艺条件为微波辐射时间3.35min、加酶比例1:1.27、复合酶用量(1:1.27)7.78mg、微波功率399.39w。在此条件下验证果胶得率为9.368%,总半乳糖醛酸为63.02%,通过工艺优化研究可知,实际果胶得率远小于预测果胶得率。

关键词:锦灯笼皮;果胶;提取;响应面分析;微波;复合酶

中图分类号:Q539.8 文献标识码:A DOI:10.11974/nyyjs.20160431002

果胶是一种可溶性纤维,具有许多对人体有益的特性,对人体的健康起一定的作用。果胶是制作人类食品和化妆品的天然成分,同时是食品添加剂联合委员会推荐和公认的安全、天然、新型、功能型食品添加剂。在食品领域中,果胶可以制作果冻,饮料,化妆品等产品。饮食中摄入果胶可促进粪便中脂肪、中性类固醇及胆汁的排泄[1]。

到目前为止,提取果胶的发法有很多,但绝大多数的果胶提取率都很低。酸法提取是目前应用最广泛的,但是对环境污染比较严重。采用酸法提取,果胶提取率低,所以寻求一种环保、高效的提取方法势在必行。目前已有微波辅助法提取果胶的报道,例如微波提取橘皮果胶工艺研究进展[2],微波辅助提取西番莲果皮中的果胶研究等[3]。本实验采用东北地区的锦灯笼为原料,采用微波辅助复合酶法对锦灯笼皮中果胶的提取进行了优化研究,并采用Box-Behnken Design实验设计对工艺进行了优化研究,通过本次的研究,获得了一种环保高效的果胶提取方法,大大的提高了果胶得率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

无水乙醇均为分析纯;纤维素酶(40U/mg)、半纤维素酶(20U/mg) 上海北诺生物科技有限公司;柠檬酸、柠檬酸三钠、锦灯笼皮产自东北[4]。

微波化学反应器 MCR-3型巩义市予华仪器有限责任公司;旋转蒸发器 RE-300型上海亚荣生化仪器厂;低速离心机 TDL-40B型上海安亭科学仪器厂;精密电子天平 FA 2004型天津天马恒基仪器有限公司;电热鼓风干燥箱 DHG-9035A型上海一恒科技有限公司;水浴锅DK-S28A型上海精宏有限公司;多功能粉碎机浙江省永康市红太阳机电有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料制备

称取100g锦灯笼皮,在沸水中煮10min,除去果皮中色素和杀死果胶当中的酶,冷却至室温,放在50℃电热鼓风干燥箱中烘干。取出干燥的锦灯笼皮置于多功能粉碎机中粉碎,制粉,过60目筛,得锦灯笼皮干粉[5]。

1.2.2 果胶提取

取一定量锦灯笼皮干粉,在一定的pH下,配制成一定料液比溶液,再向其中加入一定量的复合酶与柠檬酸缓冲溶液,置于水浴锅中在特定的温度下处理一段时间,取出放在微波化学反应器中,调节微波化学反应器在一定功率下对混合溶液进行微波辐射,处理一段时间后,取出置于90℃水浴锅中灭酶15min后,开始离心,离心参数为5000r/min,离心3min,重复3次,取上清液,提取液经旋转蒸发仪浓缩至1/3后,用1.5倍90%乙醇洗出,静置沉淀30min后进行抽滤,并用80%乙醇洗涤3次,置于50~60℃干燥箱中烘干,得粗果胶成品[6]。

1.2.3 单因素试验

利用单因素的试验方法确定最佳的复合酶比例,微波辐射时间,复合酶用量,料液比,pH,酶解温度,微波功率、酶解时间。固定实验条件为微波辐射时间为3min、半纤维素酶:纤维素酶=1:1、酶解时间为65min、复合酶用量5mg、料液比1:25、pH4.8、酶解温度50℃、微波功率400w。分别测定各单因素微波辐射时间(1min、2min、3min、4min、5min)加酶比例(1:3、1:2、1:1、2:1、3:1)、酶解时间(45min、55min、65min、75min、85min)、复合酶用量(2.5mg、5.0mg、7.5mg、10.0mg、12.5mg)、pH(4.4、4.6、4.8、5.0、5.2)、料液比(1:15、1:20、1:25、1:30、1:35)、微波功率(240w、320w、400w、480w、560w)、酶解温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)对锦灯笼皮果胶提取率的影响。

1.2.4 响应面优化

实验设计采用Design-Expert 8.0.6 软件[7]在不同单因素实验基础上,对锦灯笼皮中果胶的提取进行工艺优化实验设计见Box-Behnken Design实验设计表1。

2 结果分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 微波辐射时间对锦灯笼皮中果胶得率的影响

从图1可以看出,不同的微波辐射时间对锦灯笼皮中果胶提取率影响不同,微波辐射时间的不断增加提取率不断增加,当辐射时间为3min时候,提取率最大,之后下降。这种变化情况可能是因为果皮细胞壁被打破,果胶增多,但随着微波辐射不断延长,锦灯笼皮中果胶的1,4-糖苷键被破坏,果胶结构被破碎成许多小分子果胶,所以锦灯笼皮果胶提取率有所下降。

2.1.2 不同复合酶比例对果胶得率的影响

复合酶比例直接影响了锦灯笼皮中果胶的得率,随着复合酶比例的不断增加,锦灯笼皮果胶提取率不断增加,增加到一定比例后,果胶提取率开始下降。图2显示,最适复合酶比例应选择为1:1。

2.1.3 不同加酶量对果胶得率的影响

在底物浓度一定时,锦灯笼皮果胶提取率随加酶量的增加而升高,由图3可知加酶量达到一定程度时果胶提取率明显减缓,故选择复合酶量的添加量为7.5mg。

2.1.4 微波功率对锦灯笼皮中果胶得率的影响

微波功率对锦灯笼皮果胶得率的影响,果胶的得率呈现出先升高后下降的趋势,原因在于微波功率在一定范围内与酶产生协同作用提高果胶得率,微波功率过大果胶长链打断,小分子果胶增多,果胶得率下降。图4显示,最适微波功率应选择为400w。

2.1.5 不同料液比对果胶得率的影响

锦灯笼皮果胶提取率随料液比的增加而升高,达到一定料液比时,果胶提取率增加明显缓慢直至平稳,原因在于底物质量一定时,加入过多的溶液进行调配,果胶提取率变化不明显,同时为了节约能源,所以由图5可知,料液比最适为1:30。

2.1.6 不同pH对果胶得率的影响

pH直接影响了果胶的得率,果胶的得率呈现出先升高后下降的趋势,原因是酶的最适pH一定,随着pH逐渐增大酶的活性增加,果胶得率增加,pH达到一定时继续增加,酶的活性降低,果胶得率下降。图6显示,最适pH应选择为4.8。

2.17 酶解温度对果胶得率的影响

酶解温度影响了果胶的得率,果胶的得率呈现出先升高后下降的趋势,原因是温度升高提高酶的活性,果胶提取率增加,当温度过高时,酶活力下降,提取率下降。图7显示,最适水浴温度应选择为50℃。

水浴时间影响了果胶的得率,果胶的得率呈现出先升高后下降的趋势,原因是酶解时间过长酶活性下降,果胶提取率下降。图8显示,最适酶解时间应选择为75min。

2.2 响应面实验的结果与分析

2.2.1 Box-Behnken 工艺优化设计结果

实验设计与结果如表2所示。

2.2.2 回归方程与方差分析

根据响应面软件分析得到回归方程如下:Y=9.31+0.40A-0.17B+0.099C+0.066D+0.013AB+0.043AC+0.078AD-0.015BC+0.055BD-0.040CD-0.85A2-0.31B2-0.33C2-0.11D2

得到如表3所示的响应面回归模型和方差分析表,由表可知微波辐射时间、复合酶比例、复合酶用量、微波功率对果胶提取率都有极显著影响,每个决定系数都在可以接受范围之内,由回归方程和方差分析表可知,响应面的优化,可以较好地对锦灯笼皮果胶提取率进行预测[8]。经实验可知微波辐射时间、复合酶比例、复合酶用量、微波功率对果胶提取率影响较大,料液比、pH、酶解时间、酶解温度影响较小[9]。

各交互因素响应面见表3,由表可知 :微波辐射时间、复合酶比例、复合酶用量、微波功率对锦灯笼皮果胶提取率影响较明显,微波辐射时间直接影响果胶得率。

2.3 最佳工艺条件的确定与验证

利用Design-Expert 8.0.6软件分析模型方程,获得最佳工艺条件为微波辐射时间3.35min、复合酶比例1:1.27、复合酶用量(1:1.27)7.78mg、微波功率399.39w,在此工艺条件下模型的预测值为9.368%。由于最佳工艺条件操作起来困难,所以将条件调整为:微波辐射时间3.4min、复合酶比例1:1.2、复合酶用量7.8mg、微波功率400w、料液比1:30、pH4.8、酶解温度50℃、酶解时间75min,在此条件下,进行平行试验,得到锦灯笼皮果胶的平均提取率为9.35%,比模型的预测值小,说明在实验室进行实验操作,存在一定的环境干扰因素。

2.4 半乳糖醛酸标准曲线绘制

2.4.1 果胶测量方法依据

利用半乳糖醛酸标准品作为对照品,利用分光光度计绘制出标注曲线,测定锦灯笼外皮提取物中果胶含量[10]。

2.4.2 配制半乳糖醛酸标准溶液

称取0.1000g半乳糖醛酸标准品,加超纯水溶解,转移到100mL容量瓶中,定容。取上述溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL分别加入6个100mL容量瓶中,定容,即得到浓度分别为10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL、60ug/mL标准溶液[10]。

2.4.3 绘制标准曲线

分别移取6mL浓硫酸与6个比色皿中(2~7号,1号比色皿中加入超纯水作为空白对照),分别缓慢加入10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL、60ug/mL的半乳糖醛酸标准溶液1mL,将所配的半乳糖醛酸标准溶液置于沸水水浴锅中一段时间后取出,降到室温加入0.15%咔唑乙醇溶液0.5mL。利用分光光度计在波长为530nm测定吸光值,结果如表4,绘制出标注曲线如图15,计算得其线性回归方程为:y=0.0076x+0.0126

2.4.4 测定锦灯笼皮果胶粗产品中半乳糖醛酸的含量

称取果胶粗产品0.2500g,用50mL无水乙醇充分拌匀,在90℃时恒温水浴锅中水浴30min,取出冷却到室温,再用抽滤机对所配溶液进行抽滤,将所得物质用无水乙醇洗涤转移到烧杯当中,加入100mL盐酸使果胶粗产品进行水解,再将上述溶液转移至250mL容量瓶中,开始定容,将溶液稀释20倍,待测。利用分光光度计对所得溶液进行吸光度的测量,测定出特定浓度溶液的吸光度值,利用y=0.0076x+0.0126 R=0.9978计算出锦灯笼

3 结论

实验表明在标准曲线绘制时,在530nm处吸光度值最大,利用分光光度计测定不同浓度半乳糖醛酸标准品溶液的吸光度值,计算出其线性回归方程为:y=0.0076x+0.0126,R= 0.9978。

用东北地区所产的锦灯笼提取果胶时,提取率约为9.368%,其中果胶含量约为 63.02%,RSD为5.15%,表明回收率高,结果较准确。

采用微波辅助复合酶法提取锦灯笼果皮中果胶能有效的提高提取率,利用响应面法对工艺条件进行优化,果胶得率进一步提高。

微波辅助复合酶提取锦灯笼皮果胶的工艺优化研究发现了一种高效、环保提取锦灯笼皮果胶的方法,大大提高了果胶得率。

参考文献

[1]戴少庆,李高阳,唐汉军等.超声波辅助复合酶提取椪柑皮果胶的工艺优化[J].食品工业科技,2014,35(11):193-201.

[2]张闯,单杨.微波提取橘皮果胶工艺研究进展[J].中国食品学报,2013,13(5):147-153.

[3]黄永春,何仁,马月飞等.微波辅助提取西番莲果皮中的果胶的研究[J].食品科学,2007,28(9):161-164.

[4]陈红,崔海月,刘秀奇等.微波协同酶法提取玉米皮中的黄色素[J].食品科学,2012,36(6):50-52.

[5]汪振炯,王仁雷,吴雨龙等.微波协同酶法提取蛹虫草基质多糖工艺的优化研究[J].食品工业科技,2014,35(11):188-192.

[6]陈红,张艳荣,王大为等.微波协同酶法提取玉米须多糖工艺的优化研究[J]食品科学,2010,31(10):42-46.

[7] Vega-Estrada j,Flores-Cotera L B,Santiago A ,et al.Draw-fill batch culturemode for xylanases by Cellulomonas flavigena on sugar cane bagasse [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2002,58(4):435-438.

[8] Trupkin S ,Levin L,Forchiassin F ,et al.Optimization of a culture medium for ligninolytic enzyme production and synthetic dye decolorization using response surface methodology[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2003,30(12):682-690.

[9]余先纯.响应面优化微波加热提取橘皮果胶[J].食品研究与开发,2012,33(3):64-67.

[10]周宏,赵玉英,王冀敏.向日葵杆中果胶提取及含量测定[J].内蒙古民族大学学报,2013,28(1):28-30.

[11]翁慧,赵玉英,宋娟娟等.超声法从向日葵盘中提取果胶和果胶含量的测定[J].内蒙古民族大学学报,2010,25(1):21-23.

[12]蒋平初,金继波,张锦花.果胶含量的测定[J].化学世界,2007,28(7):124-127.

猜你喜欢

提取果胶微波
微波水云间
从五种天然色素提取废渣中分离果胶的初步研究
卵磷脂/果胶锌凝胶球在3种缓冲液中的释放行为
为什么
微波冷笑话
浅析城市老街巷景观本土设计元素的提取与置换
虾蛄壳中甲壳素的提取工艺探究
提取剂对大豆果胶类多糖的提取率及性质影响
北五味子果实中果胶的超声提取工艺研究