大黄酸神阙穴给药经皮渗透性的影响因素研究与初步机制探讨

2016-05-14封玲丁美红沈勤孙秋华石森林

中国中药杂志 2016年8期

封玲丁美红沈勤孙秋华石森林

[摘要]采用VC扩散池，分别以新鲜的离体大鼠、家兔、小型猪的神阙穴及非穴位区皮肤为渗透屏障，以20%乙醇的生理盐水为接收液，进行渗透试验，HPLC测定大黄酸含量，以累积透过量、稳态透皮速率为指标；同时采用激光共聚焦显微镜可视化观察大黄酸经皮吸收差异，考察大黄酸经神阙穴和非穴位以及不同种属动物神阙穴皮肤的渗透特性。结果显示，在24 h内大黄酸经大鼠神阙穴皮肤的累积渗透量为（10263±960） μg·cm-2，稳态透皮速率为4307 μg·cm-2·h-1，均高于经非穴位区皮肤；大黄酸经不同种属动物神阙穴给药的累积渗透量和稳态透皮速率为大鼠>家兔>小型猪，两两比较，存在显著性差异；荧光吸收图显示皮肤中的药物含量为神阙穴>非穴位，大鼠>家兔>小型猪。研究结果表明，大黄酸经皮渗透存在种属、穴位差异，经神阙穴位皮肤给药的透过量及速率显著高于非穴位皮肤，大黄酸神阙穴给药的初步机制可能是神阙穴为药物传递提供通道、载体，可视化验证了临床贴敷神阙穴治疗疾病具有特异性和优越性。

[关键词]大黄酸；神阙穴；种属；透皮特性

[Abstract]To study rhein′s permeative properties of acupoint and nonacupoint and different species′ transdermal administration in vitro Cumulative permeation amount and steadystate infiltration rate were taken as evaluative indexes to assess the permeability difference The ValiaChien diffusion cell method was used to conduct the permeability test， with fresh acupoint and nonacupoint skin of rat， rabbit and swine in vitro as permeation barriers， and blank 20% EtOH saline as absorption liquid HPLC was used to determine the rhein The absorption difference was observed by confocal laser scanning microscopy The 24hour cumulative permeation amount through acupoint skin in rats was （10263±960） μg·cm-2， the steadystate infiltration rate was 4307 μg·cm-2·h-1， both were higher than that through nonacupoint skin The thickness of acupoint skin in rat was thinner than that in rabbit and swine The cumulative permeation amount and steadystate infiltration rate of rhein in acupoint of rat were signally higher than those in rabbit and swine The absorption difference can be clearly observed through an accumulation of fluorescence In conclusion， species and acupoint all affect the permeability of rhein in vitro The permeation amount and rate of rhein on Shenque acupoint were better than that on nonacupoint skin， which could verify that treatment through Shenque acupoint is superior to that through nonacupoint The preliminary mechanism may be the drug delivery through Shenque acupoint as a channel and carrier， which is a visual verification the specificity and superiority of clinical application through Shenque acupoint in treating diseases

[Key words]rhein； Shenque acupoint； species； permeability

doi：10.4268/cjcmm20160830

穴位经皮给药是以中医经络理论为基础，将经络腧穴与经皮给药相结合，通过体表穴位吸收药物，再通过经络运行到达脏腑，在药物和经络双重作用下达到调节机体功能和治疗疾病的目的，是中医方药与针灸经络巧妙结合的产物，优于一般的经皮给药途径。研究表明，以穴位为载体的给药方式可将药物直接作用于相关脏腑，而口服、注射等给药方式需将药物吸收进入体循环，在全身广泛分布，因此穴位经皮给药具有减少药物剂量、提高疗效的优点[1]。

随着穴位经皮给药研究的不断深入，以及经络穴位给药系统在兽医临床上的应用逐渐广泛，动物模型的选择越来越受到重视。目前国内外大多采用小鼠、大鼠、裸鼠、兔、猪、犬等动物进行皮肤给药及针灸穴位的研究，但研究较为独立[24]，少见进行不同种属动物模型间的经穴位给药的比较研究。

神阙穴属互为表里的任脉、督脉，与人体诸经百脉相通；位于机体脐部，脐为胚胎发育的最后闭合处，表皮角质层薄，皮下无脂肪组织，与筋膜、腹膜相连，渗透力强。临床上常用药物贴敷神阙穴用于治疗腹泻、便秘、痛经等症，说明神阙穴在治疗腹部区域疾病方面有一定的特异性[5]。参黄方是国家级名老中医徐志瑛根据临证经验加减大承气汤而来，敷贴患者神阙穴用于治疗术后胃肠功能不全，已在全国多家医院开展，具有确切的临床实践基础，疗效显著[68]。本文前期主要从临床疗效和药效指标来阐明该方的作用机制[912]，对方中药物在给药部位的经皮吸收特性尚未深入研究。

本文以方中君药大黄的有效成分大黄酸经皮透过量和渗透系数等为指标，以非穴位区皮肤为对照，采用大鼠、家兔、小型猪3种动物神阙穴皮肤作为渗透屏障，开展经皮吸收特性研究，以期揭示参黄方神阙穴给药的科学内涵，为其临床应用提供实验依据。

1材料

大黄酸（中国食品药品检定研究院，批号110757200206，供含量测定用）；大黄酸原料药（南京景竹生物科技有限公司，批号2015021104）；甲醇、磷酸等均为色谱纯；氯化钠、乙醇等均为分析纯。

TK6H1型VC双室透皮扩散试验仪（上海锴凯科技贸易有限公司）；BT1002J蠕动泵（保定兰格恒流泵有限公司）；DF101S集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限责任公司）；Agilent 1200（美国Agilent公司）；MilliQ型纯水机（美国Millipore公司）；1/10万XS105电子天平（梅特勒托利多）；WH861 涡旋混合器（太仓市科教仪器厂）； KQ300DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；数显千分测厚仪（深圳市顺丰金电子有限公司）；Leica CM1950冰冻切片机（德国 Leica公司）；Olympus FV1000激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）。

家兔，雄性，体重（25±02） kg，合格证号SCXK（苏）20150003；小型猪，雄性，体重（30±2） kg，合格证号SCXK（沪）20140013，浙江中医药大学实验动物中心；SD大鼠，雄性，SPF级（200±20） g，合格证号SCXK（沪）20150016，上海西普尔必凯实验动物有限公司。

2方法与结果

21大黄酸含量测定方法的建立

211对照品溶液的配制取大黄酸对照品14 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL中含大黄酸0028 6 mg）。

212供试品溶液的制备取大黄原料药约2 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

213色谱条件色谱柱为Kromasil C18（46 mm×250 mm，5 μm），流动相甲醇01%磷酸（80∶20），流速1 mL·min-1，检测波长254 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。

214专属性试验取空白皮肤溶液、对照品溶液、原料药溶液及药物作用于皮肤后的透皮接收液，分别进 HPLC，结果见图1。可以看出大黄酸原料药中其他杂质成分、空白透皮液等对大黄酸的测定没有影响，透皮接收液中大黄酸的出峰时间与对照品溶液基本一致。

215标准曲线的绘制精密吸取大黄酸对照品溶液（0028 6 g·L-1）1，5，10，15，20 μL，分别注入高效液相色谱仪，测定峰面积，以对照品进样量（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为A= 3 8009C-3132 1（r=1000 0），结果表明，大黄酸在286～572 ng具有良好的线性关系。

216精密度试验精密量取上述大黄酸对照品溶液，甲醇稀释一定倍数，配制成高、中、低3个质量浓度的溶液（001，002，078 g·L-1），连续进样6次，测定大黄酸峰面积，结果其RSD分别为016%，010%，0030%，表明精密度符合要求。

A空白皮肤样品溶液；B对照品溶液；C原料药溶液；D体外透皮接收液。

图1大黄酸在不同样品中的HPLC图

Fig1HPLC chromatograms of rhein in different samples

217稳定性试验取对照品溶液于日内0，2，4，6，8，10，12，24 h进样10 μL，测定大黄酸峰面积。结果其峰面积RSD为031%，表明样品在24 h内稳定性良好。

218重复性试验分别精确称取同一批大黄酸原料药6份，按供试品制备项下制备，依法操作。结果6份原料中大黄酸含量的RSD为19%，表明该方法重复性良好。

219加样回收率试验取已知含量的大黄酸原料药9份，精密称定，分别加入一定量的大黄酸对照品，按供试品制备项下制备成加样供试品溶液，再按上述色谱条件测定，结果见表1。大黄酸的加样回收率在9589%～1050%，平均回收率为1000%，RSD为24%，符合要求。

22离体渗透试验

221神阙穴和非神阙穴的定位[13]选取大鼠、家兔、小型猪肚脐中央的神阙穴，穴位的定位参考“常用实验动物针灸穴位图谱”定位标准而定。大鼠、家兔非神阙穴的定位：在距离神阙穴区域约1 cm 处的腹部、侧部、背部皮肤，对照“穴位图谱”尽量避开其他穴位。

222离体皮肤的制备将SD大鼠、家兔、小型猪用戊巴比妥麻醉，电动脱毛器小心剃除皮肤的被毛（不得有划痕），取SD大鼠神阙穴区和腹部、侧部、背部非穴位区皮肤，以及家兔、小型猪神阙穴区皮肤，各剪成直径为25 mm的皮片。把皮肤平铺在干净的玻璃板上，让角质层向下，用小刀片或其他钝器沾生理盐水剔除皮下脂肪，然后用生理盐水反复漂洗干净，滤纸吸干，置于铝箔纸上，-80 ℃冰箱保存备用，于实验前一天取出，自然解冻，使用前用生理盐水反复淋洗至澄清。

223皮肤厚度测定分别取大鼠、家兔、小型猪的神阙穴位皮肤及大鼠腹部、侧部、背部非穴位皮肤，用千分测厚规测量皮肤的厚度，结果见表2。大鼠神阙穴区皮肤的厚度薄于非穴位区，3种动物的神阙穴区皮肤厚度大小顺序为小型猪>家兔>大鼠。将其进行两两比较，可以看出大鼠腹部非穴位皮肤与神阙穴区域在皮肤厚度上无显著差异，其余各组均有极显著差异（P<001）。

224渗透试验采用TK6H1型VC双室透皮扩散试验仪，扩散池容积5 mL，内径12 cm，有效渗透面积A为113 cm2。取离体低温保存的皮肤固定于扩散池的结合部，皮肤的角质层面向供给池，池中加入一定质量浓度的大黄酸溶液；接受池内加入接受液（20%乙醇的生理盐水）。扩散池水浴外套与蠕动泵和恒温加热磁力搅拌器相接，保持恒温恒速搅拌，水浴温度（32±05） ℃，转速220 r·min-1。于05，1，2，4，6，8，10，12，24 h时间点取样，每次取出全部接受介质，然后用等温度的含20%乙醇的生理盐水补充至原体积量。所取样品经045 μm微孔滤膜过滤，取续滤液进样测定（若样品浓度低于大黄酸含量测定的线性范围，蒸干后用甲醇稀释），计算药物的累积透过量及稳态透过速率。

225数据处理按下式计算校正药物浓度（Cn校）、单位面积累积渗透量（Qn），稳态透过速率（Js）、渗透系数（P）。以不同时间的Q对时间t做图，该图的直线部分斜率即为Js。

Cn校=Cn+∑n-1i=1Ci

Qn=Cn校·V/A

P=Js/C0

式中，Cn校为t时间药物的校正质量浓度（mg·L-1），Ci为t时间前药物的测定质量浓度（mg·L-1），Cn为t时间药物的测定质量浓度（mg·L-1），V 为接受池中接受液体积（mL），A为扩散池面积（cm2），C0为供给池中供试药物质量浓度（mg·L-1）。

23大黄酸经大鼠神阙穴与非穴位皮肤渗透性研究

231大黄酸经离体大鼠神阙穴与非穴位皮肤的渗透曲线取离体大鼠神阙穴、腹部非穴位、侧部非穴位、背部非穴位皮肤，固定在供给池与接受池之间，供给池中加入大黄酸过饱和溶液，按照224项中方法操作；根据225项中公式计算累积渗透量，以累积渗透量对时间t作图，得到相应的渗透曲线，见图2，在24 h内，大黄酸经神阙穴皮肤的累积渗透量Qn为（102631±9602） μg·cm-2，每个时间点的神阙穴区累积渗透量均高于非神阙穴区皮肤。

232大黄酸经大鼠神阙穴与非穴位皮肤的相关渗透参数按照225项中公式计算大黄酸经大鼠神阙穴与非穴位皮肤的稳态透过速率（Js）、相关系数r及渗透系数（P），结果见表3。大黄酸经4个区域离体皮肤的的稳态透皮速率与渗透系数的大小顺序为神阙穴>腹部非穴位>侧部非穴位>背部非穴位，将神阙穴与非穴位的相关渗透参数进行两两比较，t检验结果表明大黄酸经大鼠神阙穴与经腹部、侧部、背部非穴位皮肤的累积渗透量、稳态透皮速率与渗透系数之间均存在极显著差异（P<001），经神阙穴的渗透系数为非穴位的13～25倍，以上结果表明药物经神阙穴给药渗透得更快更多，神阙穴位皮肤更有助于药物的渗透吸收，间接验证了参黄方临床贴敷神阙穴的科学性。

24大黄酸经不同动物神阙穴区皮肤渗透性

241大黄酸经不同动物神阙穴区皮肤的渗透曲线分别取大鼠、家兔、小型猪的神阙穴区皮肤，固定在供给池与接受池之间，供给池中加入大黄酸过饱和溶液，按照224项中方法操作；根据225项中公式计算累积渗透量，以累积渗透量对时间t作图，得到相应的渗透曲线，见图3，在24 h内，大黄酸经大鼠神阙穴皮肤的累积渗透量Qn高于家兔和小型猪，是家兔的6倍，小型猪的46倍，不同种属间的经皮吸收差异显著。

242大黄酸经不同动物神阙穴区皮肤的相关渗透参数按照225项中公式计算大黄酸经大鼠、家兔、小型猪神阙穴区皮肤的稳态透过速率（Js）、相关系数r及渗透系数（P），结果见表4。大黄酸经3种动物神阙穴区皮肤的累积渗透量、稳态透皮速率与渗透系数的大小顺序为大鼠>家兔>小型猪。将3种动物的相关渗透参数进行两两比较，t检验结果表明各组之间均存在极显著差异（P<001），表明同一药物在不同种属动物同一穴位经皮给药，渗透

25大黄酸在不同种属动物神阙穴区皮肤组织中的分布

为进一步考察神阙穴与非穴位区皮肤给药后，药物在皮肤的分布情况，按照224项下离体经皮渗透实验的方法，分别将给药1，3，6，12，24 h的皮肤全部剪下，进行纵向冰冻切片，切片厚度20 μm，得到皮肤的横截面。利用大黄酸的自发荧光特性，将其置于激光共聚焦显微镜下观察，选择激发波长488 nm，发射波长530 nm，进行扫描摄图，结果见图4。图中从左到右依次为皮肤的角质层、活性表皮、真皮，角质层区域的荧光为绿色连续带状。荧光强度和药物含量成正比关系，即荧光强度越强，皮肤内药物含量越高。图A为空白皮肤，无荧光；图B～F为不同种属动物神阙穴与非穴位皮肤，随着时间推移，荧光强度逐渐增强，区域逐渐扩大，说明经皮渗透量逐渐增高，动态展现了药物经皮吸收的过程。图B为大鼠神阙穴区皮肤，各时间点的荧光强度最强，说明大黄酸透过的含量最高，与经皮渗透试验结果一致。将家兔神阙穴（C）与非穴位区皮肤（D）比较，神阙穴区皮肤可见明显的药物富集区域，类似贮库。大鼠、家兔、小型猪的神阙穴区皮肤均可看到块状荧光区，而非穴位区只有点状荧光区，提示穴位区的皮肤可能为药物传递提供某种通道或载体，有助于药物在皮肤中短暂滞留和进一步渗透。

26皮肤厚度与经皮渗透系数的相关性

采用SPSS 170统计软件中的Pearson相关分析，分析皮肤厚度对不同种属动物神阙穴及大鼠腹部、侧部、背部非穴位经皮给药的经皮渗透系数之间的相关性。皮肤厚度对不同种属动物神阙穴经皮给药的经皮渗透系数呈中度负相关（r=-0747）；对大鼠腹部、侧部、背部非穴位经皮给药的经皮渗透系数呈高度负相关（r=-0948，P<005）。结果表明药物吸收的经皮渗透系数与皮肤厚度有一定相关性，且种属差异大于部位差异；皮肤越厚，经皮渗透系数越小，同一药物浓度的稳态透皮速率越低，药物经皮吸收越慢。

3讨论

神阙穴位于任脉，为冲任循行之所，冲、任与督为“一脉三歧”，三脉经气相通，因奇经八脉纵横，故神阙贯穿于十二经脉之中，气通百脉。神阙穴位于机体脐部，脐为生命根蒂，神元归藏之本，五脏六腑之根，经络经气之总，有调节脏腑气血功能的作用。因而神阙不仅是一个可见可触的脐部穴位，更是一个包括中枢脉、祖窍、膻中在内的微观调控系统。薄智云等在脐周发现了与全身应答关系明确、排布有序的穴区带，认为以神阙为轴的腹部不仅有一个与全身气血运行有关的循环系统，还有一个全身高级调控系统，即神阙穴调控系统，该理论认为这个系统是敷脐疗法和腹针的物质基础[14]。目前对中药穴位给药的研究主要集中在药物传递、经络与神经信息传导等方面，本文利用经皮给药的现代药剂学研究方法，比较大黄酸在神阙穴和非穴位皮肤中的透皮特性。

种属和给药部位差异对大黄酸透皮吸收存在影响，皮肤厚度是引起差异的间接因素之一，与皮肤的角质层细胞层数、皮肤附属器密度、皮肤的生化成分等因素亦密不可分。不同种属动物的皮肤厚度差异显著，毛质地不一，家兔的毛比较柔软细密，小型猪的毛则稀疏粗硬；毛孔数量、毛囊大小等也都不同，这可能是造成大鼠、家兔、小型猪这3种动物对大黄酸经神阙穴皮肤的渗透系数有显著性差异的主要因素，也有可能是穴位在不同种属动物上对药物的刺激不同。实验设计时，合理使用实验动物模型是临床前研究数据能否外推的重要基础[15]。大黄酸神阙穴给药经皮渗透性存在一定的种属差异，在经皮渗透实验的动物选择以及将动物实验结果外推至人时应考虑到不同动物之间的种属差异性。

参黄方组成为大黄、丹参、厚朴、枳实等，因考虑到小型猪皮肤角质层较厚，有效成分透过量低，影响检测，在对君药大黄中5种游离蒽醌的经皮渗透性比较的预实验中，发现大黄酸的渗透性最佳，稳态透皮速率高于芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚，与相关文献报道一致[16]，因而以大黄酸原料药代表参黄方进行透皮试验，探讨不同种属动物神阙穴及其与非穴位皮肤的吸收差异。

大黄酸是一种脂溶性药物，几乎不溶于水，难溶于生理盐水和磷酸盐缓冲液（PBS），在脂溶性药物的透皮实验中，常加入一些表面活性剂或醇类来改善其在接受液中的溶解度，从而维持漏槽条件[1719]。本文前期考察了大黄酸在不同体积分数乙醇中的溶解度，其在10%，20%，30%，40%，50%乙醇中的溶解度分别为0015，0016，0024，0040，0063 g·L-1，且性质稳定。预实验中，分别考察了含30%，20%，10%乙醇的生理盐水及不含醇的生理盐水作为接收液，结果含醇的生理盐水不仅可以增加大黄酸的溶解度，而且有一定的促渗作用，为与生理环境接近，选择含20%乙醇的生理盐水作为接受液。

激光共聚焦显微镜对具有自发荧光特性的药物，可以动态、连续地扫描组织、细胞的固定范围，记录药物的动态变化，并定量分析，还可以获得组织细胞形态学改变的三维图像[20]，有望成为中药渗透动力学研究的新技术。荧光吸收图动态展现了大黄酸在皮肤各层的渗透情况，可视化验证了其在神阙穴区皮肤的药物含量高于非穴位区，神阙穴区皮肤出现荧光强度明显的药物富集区，类似贮库，这与相关文献观点一致[21]。药物渗透快于非穴位区，为临床施用参黄方敷贴神阙穴用于防治术后胃肠功能不全提供了实验支持。

穴位和非穴位差异对大黄酸神阙穴给药经皮渗透的影响较大，以往研究认为皮肤厚度是影响药物渗透的主要因素，本文对大黄酸神阙穴皮肤与周边腹部皮肤的渗透试验比较，发现药物的累积透过量、稳态透皮速率与渗透系数存在显著差异，经神阙穴吸收高于非穴位皮肤，而两者皮肤厚度相近，提示皮肤厚度只是引起穴位与非穴位区经皮吸收差异的因素之一。

通过神阙穴与非穴位区皮肤离体经皮渗透实验比较，发现大黄酸经神阙穴位皮肤的透过量高、透皮速率快，结合其在激光共聚焦显微镜下的荧光吸收图，初步判断大黄酸神阙穴给药的机制可能是经络在运行气血时，也为物质传递提供通道、载体。根据中医整体观念，经络穴位受到神经内分泌及血液循环的影响，对于大黄酸神阙穴给药经皮吸收的机制研究还需要结合整体动物实验，对药物经皮吸收后的分布进行追踪，因此大黄酸神阙穴给药的具体机制尚有待于进一步从整体动物水平进行研究。

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