芩百清肺浓缩丸对肺炎支原体感染大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞修复作用的研究

姚琳 张俊威 王博 隋美娇 王伟

[摘要]通过对转化生长因子β（TGFβ）和表面活性相关蛋白A（SPA）给药前后的表达变化及分布，探讨芩百清肺浓缩丸对肺炎支原体（MP）感染大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的修复作用机制。取60只Wistar大鼠，雌雄各半，体重80～100 g，随机分为6组，每组10只，分别为空白组，模型组，阳性对照组，芩百清肺浓缩丸高、中、低剂量组，采用滴鼻法造模；给药10 d后收集大鼠肺泡灌洗液、血清、左肺及右肺组织中叶，采用免疫组化法检测肺组织中TGFβ及SPA的蛋白表达及分布；实时荧光定量PCR法测定肺组织中TGFβ，SPA mRNA的表达；酶联免疫法测定血清及肺泡灌洗液（BALF）中SPA的含量。通过数据分析可知，芩百清肺浓缩丸能够下调肺组织中TGFβ的表达，增加SPA的表达，其中TGFβ主要分布于肺间质，SPA主要分布于AECⅡ及部分肺泡巨噬细胞内；同时，能够降低血清中SPA含量，增加BALF中SPA含量。通过以上结果可知，芩百清肺浓缩丸通过降低TGFβ的表达抑制AECⅡ发生上皮间质转化，并增加SPA的表达，恢复肺的正常形态与功能；同时，对MP引起的肺组织毛细血管损伤具有一定的修复作用。

[关键词]肺炎支原体；芩百清肺浓缩丸；肺泡Ⅱ型上皮细胞；转化生长因子β；表面活性相关蛋白A

[Abstract]To discuss the repair mechanism of Qinbai Qingfei concentrated pellets to AECⅡ of rats infected by mycoplasma through the observation of the changes and distribution of TGFβ and SPA in lungs， totally 60 Wistar rats that weighing 80100 g were collected， with male and female in half The rats were divided into six groups randomly， with 10 rats each group， namely blank group， model group， positive group and Qinbai Qingfei concentrated pellets high， middle and low dose groups Rats were infected through nasal intubation drip of MP After 10 days of administration， serum and bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were collected to detect the concentration of surface activity related protein A （SPA） by ELISA， left pulmonary tissues of rats were collected to observe the expression and distribution of transforming growth factorbeta （TGFβ） and SPA by immunohistochemistry， and right pulmonary tissues were taken to detect TGFβ and SPA mRNA expression level by realtime quantitative PCR （RTPCR） Qinbai Qingfei concentrated pellets can reduce the expression of TGFβ and increase the expression of SPA in the lung tissues of rats infected by mycoplasma Specifically， TGFβ was mainly distributed among the lung interstitium， while SPAs were mainly distributed in AECII and parts of alveolar macrophage The level of SPA was reduced in serum and increased in BALF in rats in Qinbai Qingfei concentrated pellets groups It was proved that Qinbai Qingfei concentrated pellets can restore the normal morphology and function of the lung by reducing the content of TGFβ to inhibit epithelialmesenchymal transition （EMT） of alveolar type II epithelial cells and increasing the expression of SPA Qinbai Qingfei concentrated pellets have the repairing ability to capillary vessel damage caused by MP in lung tissues of rats

[Key words]Mycoplasma Pneumoniae； Qinbai Qingfei concentrated pellets； AECⅡ； TGFβ； SPA

doi：10.4268/cjcmm20160821

肺炎支原体（Mycoplasma pneumonia，MP）是引起呼吸道感染常见的病原体，目前临床上对于肺炎支原体肺炎（Mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）的治疗主要应用大环内酯类抗生素，但是该类抗生素不良反应大、副作用强，在杀灭支原体的同时对患者的机体造成一定的损伤，且耐药率呈逐年上升的趋势[1]。因此，开发一种既可以杀灭支原体又可以促进受损肺组织修复的药物显得尤为重要。

芩百清肺浓缩丸（以下简称“芩百”）是黑龙江省中医药科学院自主研发，经国家审批的第一个用于临床研究治疗小儿支原体肺炎的中药新药，由黄芩、百部、地龙、桔梗、麦冬、紫菀6味中药组成，实验研究和临床观察证明其有较好的抗MP，止咳及修复受损肺组织等功效[25]。

肺泡Ⅱ型上皮细胞（type Ⅱ alveolar epithelial cell，AECⅡ）是肺泡上皮的干细胞，是合成和分泌肺泡表面活性物质及其相关蛋白的主要细胞[6]。MP感染宿主后，引起的主要病理表现为间质性肺炎，导致AECⅡ受损，病情严重者或反复发作可引起上皮间质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT），即上皮细胞失去上皮属性。转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ）是一种由多种细胞分泌的具有多重生物学效应的多肽类细胞因子，研究发现，TGFβ在AECⅡ发生EMT过程中起着非常重要的调节作用[78]。AECⅡ损伤后[910]，可诱导上皮通透性增加，降低肺表面活性物质相关蛋白A （surfactantassociated protein A，SPA）的合成和分泌，SPA含量的降低使肺组织失去保护屏障则导致其损伤进一步加重。

本研究通过比较给药前后，肺炎支原体感染大鼠肺组织中TGFβ和SPA表达的变化，阐明芩百对AECⅡ的修复作用，从而为其促进肺组织修复、恢复肺功能的作用机制提供理论基础。

1材料

芩百清肺浓缩丸（哈尔滨天合力制药有限公司，批号130701），本品为棕褐色的薄膜包衣浓缩水丸，经检查符合2010年版《中国药典》丸剂下的各项规定。

肺炎支原体国际标准株（ATCCFH15531，美国菌种保藏中心）；PPLO培养基（Becton，Dickinson and Company，USA）；TRIzol试剂（美国Invitrogen，批号66211）；Transcriptor first strand cDNA Synthesis Kit（Roche公司，批号1485422）；Fast Start Universal SYBR Green Master （ROX）（Roche 公司，批号10277200）；SPA，TGFβ，βactin引物（哈尔滨博仕生物技术有限公司）；TGFβ多克隆抗体（ABCAM公司）；SPA多克隆抗体（SANTA公司）；SPA检测试剂盒（酶联免疫吸附试验法，SEA890Ra 96T，L140724594，Uscn）；浓缩型DAB试剂盒（中杉金桥）；二步法免疫组化试剂盒（中杉金桥）。

Wistar大鼠，60只，雌雄各半，体重80～100 g，长春亿斯实验动物技术有限公司提供，SPF级，许可证号SCXK（吉）20110004。

SorvaⅡ ST16低温离心机（Thermo公司）；KDTS3A自动组织脱水机（浙江金华科迪仪器设备有限公司）；KDBM生物组织包埋机（浙江金华科迪仪器设备有限公司）；RM2235组织切片机（德国莱卡）；BX41生物显微镜（OLYMPUS公司）；DP72 组织生物信号采集分析系统（OLYMPUS公司）；Infinite M200 Pro酶标仪（Tecan公司）；9600定量PCR检测仪（杭州博日）。

2方法

21动物分组、造模及给药60只Wistar大鼠随机分为6组，每组10只，雌雄各半，分别为空白对照组，模型对照组，阳性对照药组，芩百高、中、低剂量组。大鼠适应性饲养1周后，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，除空白对照组外，其余各组大鼠鼻孔内缓缓滴入1×106 CCU·mL-1 MP菌液50 μL，利用其自然吸气式动作将菌液吸入气道至肺部，空白对照组滴入等量MP培养液。感染后第2天开始灌胃给药，每日1次，空白对照组和模型对照组灌胃等容积生理盐水；阳性对照组灌胃阿奇霉素（首次给药量为45 mg·kg-1·d-1，第2～5天为225 mg·kg-1·d-1），连续给药5 d；芩百高（32 g·kg-1·d-1）、中（16 g·kg-1·d-1）、低（08 g·kg-1·d-1）剂量组连续给药10 d。1%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血，分离血清-80 ℃冻存，用于检验血清中SPA含量；收集肺泡灌洗液-80 ℃冻存备用，用于检验肺泡灌洗液（BALF）中SPA含量；剪取左肺组织4%甲醛固定，用于免疫组化检测；剪取右肺组织中叶，用于提取RNA。

22大鼠肺组织TGFβ，SPA蛋白检测取甲醛固定的肺组织，用乙醇梯度脱水，二甲苯中透明2次，放入石蜡内进行包埋。蜡块修好后固定于石蜡切片机上切片，将完全展开的蜡片贴附于清洁载玻片上，68 ℃恒温箱内烤片2 h，采用二步法免疫组化检测，用显微镜观察组织染色情况。

23大鼠肺组织TGFβ，SPA mRNA检测以实时荧光定量PCR法检测TGFβ和SPA mRNA的表达。提取RNA，用酶标仪对RNA 纯度及浓度进行测定，根据 RNA 浓度调整总 RNA 的体积，使各样品逆转录体系所含的 RNA 量相同，将RNA逆转录为cDNA，以逆转录合成的cDNA为模板，进行聚合酶链反应。引物序列[1113]：TGFβ上游5′GGCGGTGCTCGCTTTGTA3′，下游5′GCCACTCAGGCGTATCAG3′；SPA上游5′TAAGTGCTGCCCTCTGACCT3′，下游5′AGGAGCCATACATGCCAAAC3′；βactin上游5′CGTTGACATCCGTAAAGAC3′，下游5′TGGAAGGTGGACAGTGAG3′。

24大鼠血清及BALF中SPA的测定采用ELISA法检测，根据预实验，血清和BALF样品分别稀释100倍、1 000倍后测定，操作程序按照ELISA试剂盒要求进行。

25统计分析采用 SPSS 180 软件进行统计学分析，数据用±s表示，2组间均数比较采用独立样本t检验，以P<005为差异有统计学意义。

3结果

31大鼠肺组织TGFβ，SPA蛋白表达的免疫组化检测显微镜下观察，放大200倍，每组每张片子选3个视野，分别测每个褐色斑点的MOD，求和并取平均值，用IPP软件分析，颜色越深，表达越强。

通过对TGFβ蛋白表达检测可知，空白对照组大鼠肺组织中在肺间质及肺泡壁周围可见少量的TGFβ蛋白表达，在肺泡浆内可见弱的黄色颗粒，且着色较浅；与空白组比较，模型组大鼠肺间质及肺泡壁周围的TGFβ蛋白表达明显，可见大量棕黄色颗粒，病灶内血管、支气管周围渗出的部分炎症细胞、肺泡间隔中的间质细胞均有深黄色颗粒，胞浆内棕黄色颗粒着色较深，分布密集，个别可见团块状分布，具有显著性差异（P<001）；与模型组比较，芩百各剂量组TGFβ蛋白表达明显下降（P<005），且高剂量组下降明显（表1，图1）。

通过对SPA蛋白表达检测可知，空白对照组可见SPA表达丰富，密集而深，分布于AECⅡ及部分肺泡巨噬细胞内，呈棕黄至棕褐色颗粒，肺泡及细支气管腔内可见一层深棕色物质；与空白对照组比较，模型对照组SPA表达则较分散，着色较浅，呈棕褐色颗粒，具有显著性差异（P<001）；与模型组比较，芩百高、中剂量组SPA表达提高（P<005），可明显观察到AECⅡ内棕黄色颗粒数量和颜色增多、变深（表1，图2）。

32大鼠肺组织TGFβ，SPA mRNA表达与模型组比较，芩百各剂量组TGFβ基因表达明显下降（P<005），且高剂量组下降明显；而SPA基因表达明显增加（P<005），同样高剂量组表达更加明显（表2）。33大鼠血清及BALF中SPA的含量测定与空白对照组比较，模型组血清中SPA含量明显上调（P<001），而BALF中SPA含量下调（P<005）；与模型组相比，阳性对照组血清中SPA含量变化不显著，BALF中SPA含量略有上调，但均无统计学意义，芩百高、中、低各组血清中SPA含量下调（P<005），BALF中SPA含量增加（P<005）（表3）。

4讨论

TGFβ为胞浆型表达的细胞因子，其阳性表达

产物呈棕黄色颗粒状分布于胞浆中，各组大鼠肺组织中TGFβ表达主要分布于肺间质，也见于肺泡壁，阳性表达颗粒主要位于胞质内，颜色越深表达越强。通过模型组与空白对照组对比可以看出，MP感染大鼠后，由于外界的刺激导致TGFβ的分泌量增多，促使上皮细胞向间质细胞的转变，而各给药组TGFβ的蛋白表达降低，说明药物能够通过降低TGFβ的蛋白表达减轻炎症反应，抑制上皮细胞向间质细胞的转变过程。

SPA主要分布于AECⅡ及部分肺泡巨噬细胞内，免疫组化染色后呈棕褐色颗粒，空白对照组SPA分布密集，且着色较深；而与空白对照组比较，模型对照组SPA表达则较分散，着色较浅，说明MP感染大鼠后，SPA的蛋白表达降低，提示AECⅡ受损，肺组织失去保护屏障，其正常生理功能受到影响。与模型对照组比较，各给药组能够提高SPA的蛋白表达量，说明药物对受损的AECⅡ具有修复的作用，促进其分泌和合成SPA，恢复肺的正常生理功能，使其进入良性的生理状态。

MPP大鼠肺组织中TGFβ及SPA mRNA的检测结果表明，大鼠感染MP后肺组织中TGFβ mRNA显著上调，而SPA mRNA表达下降，提示MP感染在引起间质性肺炎的过程中可增加肺组织中TGFβ的分泌，提高TGFβ mRNA表达，促进AECⅡ的上皮间质转化；AECⅡ发生上皮间质转化后，SPA分泌减少，SPA mRNA表达下降，加重了肺组织的炎症反应程度。与模型对照组比较，各给药组肺组织TGFβ mRNA表达显著下调，同时SPA mRNA表达显著提高，并显现明显的量效关系，提示芩百能够减少肺组织中TGFβ的分泌，降低TGFβ mRNA表达，抑制AECⅡ的上皮间质转化过程，恢复AECⅡ的正常形态和功能；AECⅡ功能得以恢复的同时，促进SPA的合成和分泌，SPA mRNA表达上调，则进一步维护肺组织的正常形态和生理功能。

SPA可用来评价肺气血屏障的完整性，也可作为MP感染肺组织后AECⅡ功能的早期指标。SPA的合成和分泌具有一定的肺特异性，主要由AECⅡ表达。正常情况下，SPA在血液中是不表达或表达很微量的，但当宿主被感染时，肺泡上皮细胞和周围毛细血管受到炎性细胞的浸润而造成不同程度的损伤，肺泡毛细血管通透性增加，SPA从肺泡腔渗漏到通透性增强的肺泡毛细血管中并随血流入血[14]，导致在体循环血液中SPA水平上升，因此可根据血清中SPA的水平来反应肺损伤的严重程度。

MPP大鼠肺泡灌洗液和血清中SPA的含量检测结果表明，大鼠感染MP后其BALF中SPA含量明显下降而血清中SPA含量明显增高，提示MP感染后AECⅡ及毛细血管受损。与模型组比较，各给药组均能增加BALF中SPA含量，同时降低血清中SPA含量。提示芩百能够保护AECⅡ合成和分泌SPA的功能，并减轻MP感染引起的炎症反应及毛细血管损伤，维持肺组织的正常形态和功能。而阳性对照组与模型组比较，BALF和血清中SPA含量均无显著差异，说明阿奇霉素虽然具有良好的抗MP作用，但对MP感染和炎性细胞浸润引起的毛细血管损伤的修复作用不明显。

本研究结果表明，芩百清肺浓缩丸通过降低TGFβ表达，抑制AECⅡ发生EMT，促进AECⅡ合成和分泌SPA，并对炎性细胞浸润引起的毛细血管损伤具有较好的修复作用，阻止SPA进入体循环，增加肺组织中SPA的含量，从而对肺组织起到保护和修复的作用，恢复其正常形态和生理功能。

[参考文献]

[1]马晓丽，郑跃杰肺炎支原体对大环内酯类药物耐药研究[J]临床儿科杂志，2013，31（6）：596

[2]王伟明，张俊威，许庆瑞，等芩百清肺浓缩丸体内外抗肺炎支原体作用的实验研究[J]中草药，2008，39（5）：742

[3]王伟明，李继昌，张洪娟呼畅清肺浓缩丸对肺炎支原体感染鼠肺组织钙粘附分子表达的研究[J]中国中药杂志，2005，30（21）：1682

[4]Meng Y，Huo J，Lu W，et al Modulation of P1 and EGF expression by baicalin[J] Int J Mol Sci，2012，14（1）：146

[5]蒙艳丽，杨阳，王欣，等芩百清肺浓缩丸对肺炎支原体感染模型小鼠和细胞肺表皮生长因子表达的影响[J]中华中医药杂志，2014，29（4）：1089

[6]杨青，王桂芳肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的研究进展[J]复旦学报：医学版，2012，39（6）：658

[7]Valcourt U，Kowanetz M，Niimi H，et al TGFbeta and the Smad signaling pathway support transcriptomic reprogramming during epithelialmesenchymal cell transition[J] Mol Biol Cell，2005，16（4）：1987

[8]Zhou B，Buckley S T，Patel V，et al Troglitazone attenuates TGFβ1induced EMT in alveolar epithelial cells via a PPAR γindependent mechanism[J] PLoS ONE，2012，7（6）：e38827

[9]Ahmad I M，Britigan B E，Abdaila M Y.Oxidation of thiols and modification of redoxsensitive signaling in human lung epithelial cells exposed to Pseudomonas pyocyanin[J].J Toxicol Environ Health A，2011，74（1）：43.

[10]田丹.GSK3在吸烟致气道上皮和肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤修复中的作用研究[D].武汉：华中科技大学， 2006

[11]Martin R J，Chu H W，Honour J M Airway inflammation and bronchinal hyperresponsiveness after Mycoplasma pneumoniae infection in a murine model[J] Am J Respir Cell Mol Biol，2001，24（5）：577

[12]何蓉高氧肺损伤新生大鼠肺组织中肺表面活性物质相关蛋白A（SPA）的mRNA和蛋白表达及布地奈德的干预作用[D]苏州：苏州大学，2013

[13]Hu Q J，Zhang H L，Xiong S D，et al The alteration and significance of surfactant protein A in rats chronically exposed to cigarette smoke[J] J Huazhong Univ Sci Technol，2008，28（2）：128

[14]Todd D A，Marsh M J，George A，et al Surfactant phospholipids，surfactant proteins，and inflammatory markers during acute lung injury in children[J] Pediatr Crit Care Med，2010，11（1）：82

[责任编辑马超一]