贵州遵义地区82只健康蝙蝠脑组织博尔纳病毒核蛋白检测

雷以会，徐平，杨利玲 (遵义医学院附属医院，贵州遵义 563000)



·基础研究·

贵州遵义地区82只健康蝙蝠脑组织博尔纳病毒核蛋白检测

雷以会，徐平，杨利玲 (遵义医学院附属医院，贵州遵义 563000)

摘要：目的观察贵州遵义地区蝙蝠脑组织博尔纳病毒(BDV)感染情况。方法 采用Western blotting法检测贵州遵义地区82只健康蝙蝠脑组织中BDV核蛋白。结果蝙蝠脑组织BDV核蛋白阳性率为12.2%(10/82)。结论贵州遵义地区健康蝙蝠存在BDV感染。

关键词：博尔纳病毒；蝙蝠；核蛋白；蛋白质免疫印迹法

博尔纳病毒(BDV)[1]是一种非细胞溶解性和严格嗜神经性的RNA病毒，可以持续感染中枢神经系统。健康啮齿动物感染BDV后，表现出以行为异常、运动障碍及精神异常为特征的严重神经功能紊乱[2]。目前关于人和动物BDV自然感染的研究[3～5]遍布全球，在中国也存在BDV的散在感染。学者们曾在蝙蝠体内分离出80多种病毒，除狂犬病毒、SARS样冠状病毒、乙型脑炎病毒等常见病毒外，还有亨德拉病毒[6]和尼帕病毒[7]等新发病毒。由此可见，蝙蝠可成为多种病毒性人畜共患病的重要传媒。BDV作为一种新发的传染性病毒，国内外尚无蝙蝠与BDV相关性的研究。本研究采用蛋白质免疫印迹法对贵州遵义地区82只健康蝙蝠脑组织BDV核蛋白进行检测，现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1实验标本82只蝙蝠采集于贵州省遵义市，样本采集时间为2014年5～9月，未区分蝙蝠种类、雌雄及年龄等，每例取同侧新鲜额颞叶脑组织约250 mg，分装在去RNA酶EP管中，-80 ℃冰箱保存。

1.2主要试剂及仪器磷酸化蛋白提取试剂盒(Key GEN)；蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime)；BDV核蛋白(BDV-P40)多克隆抗体、碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG、BDV阳性蛋白均由重庆医科大学神经科学研究中心提供。电泳仪(美国Bio-Rad)，电转仪(美国Bio-Rad)，水平摇床(北京恒奥)，荧光显微照相系统(日本Nikon)。

1.3脑组织BDV核蛋白检测每只蝙蝠称取额颞叶脑组织100 mg，加入RIPA蛋白提取试剂，超声裂解，10 000 r/min离心5 min，取上清液，采用BCA法进行蛋白定量，取样品蛋白150 μL，用4×loading buffer按1∶4稀释，100 ℃恒温箱放置10 min，保存于-20 ℃冰箱备用。将BDV阳性标本蛋白上样于12%SDS-PAGE胶上电泳，采用半干转膜法，转膜40 min，将胶上的蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h，封闭完毕后，将PVDF膜切成0.5 cm宽的小条，分别与不同稀释浓度的BDV-P40多克隆抗体(1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000)和碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG(1∶5 000、1∶10 000)的组合交叉体系进行反应，根据曝光效果，确定最佳抗体稀释浓度。样本蛋白上样后经电泳、电转、封闭，BDV-P40多克隆抗体按1∶1 000稀释，4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗涤3次，10 min/次，碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IgG按1∶5 000稀释，摇床孵育2 h，TBST洗涤3次，10 min/次，将膜晾干后，在膜上滴适量显影液，反应3 min，胶片曝光。将目的条带处于40 kD处的标本视为阳性，每次实验均设阳性对照。反复验证阳性标本，最终确定阳性结果。

2结果

蝙蝠脑组织BDV核蛋白阳性率为12.2%(10/82)，其电泳结果见图1。

3讨论

BDV可以引起传染性脑脊髓炎，即博尔纳病(BD)，可以感染包括人在内的所有恒温动物。BD是一种免疫介导的神经综合征，以大量炎症细胞浸润脑膜及脑实质、特异性抗原在边缘系统神经元中聚集为特征，BDV在中枢神经系统中主要破坏大脑齿状回及边缘系统的神经细胞，临床上主要表现为认知、行为及情感的异常等[8]。BDV广泛存在于人类疾病中，主要与抑郁症、双向情感障碍、精神分裂症、慢性疲劳综合征、获得性免疫缺陷综合征性脑病、多发性硬化、运动神经元病、帕金森综合征和脑肿瘤等神经精神疾病相关[9，10]。

注：1～10为阳性标本，+为阳性对照。

图1蝙蝠脑组织BDV核蛋白电泳结果

王长明等[11]用巢式逆转录PCR(FQ-nRT-PCR)对贵州遵义及周边地区的300只山羊进行检测，其中有20例标本发现了BDV-P24基因片段；刘海军等[12]采用相同方法对贵州省及部分周边地区牛的BDV-P24基因片段进行检测，阳性率为4.17%；还有研究者[13，14]在一些神经精神疾病患者的血液或脑脊液检测出BDV感染；证实贵州地区人和动物存在BDV自然感染。贵州地属喀斯特地形，且贵州地区属于亚热带湿润季风气候区，气候温暖湿润，为蝙蝠的生活创造了有利的条件。随着生活水平的不断提高，城乡结合越发紧密，部分蝙蝠可能在城中定居，使人类与蝙蝠的接触愈发密切。一般认为，BDV可以通过动物的唾液和鼻腔分泌物等进行传播，动物可通过直接接触患病动物的分泌物或食用被污染的食物而感染。根据贵州的地理环境及蝙蝠的生活习性，蝙蝠作为BDV自然宿主的可能性较大。

本研究在课题组其他成员前期研究的基础上，采用蛋白质免疫印迹法对蝙蝠脑组织BDV核蛋白进行检测，发现BDV核蛋白阳性标本10例，BDV-P40检出率12.2%。本实验选用了敏感性及特异性均较高的Western blotting法，使实验数据更具说服力。本实验采用的BDV-P40多克隆抗体由重庆医科大学神经科学研究中心提供，具有良好的特异性及敏感性。本实验对待测标本分别进行了3次检测，对2次及以上阳性的标本进行了多次确认，得到的实验结果无变化，充分体现本实验的特异性。

不同地域不同物种BDV检出率不同，法国学者采用nRT-PCR对171只动物(包括马、牛、狐狸、狗、羊)进行BDV检测，发现只有1例牛脑组织中含有BDV-P24基因片段[15]。刘建等[16]采用FQ-nRT-PCR对宁夏地区163只绵羊脑组织中BDV-P24、BDV-P40进行检测，其中两者均为阳性的有6例(3.68%)。冯裕星等[17]采用FQ-nRT-PCR分别对新疆伊犁地区200匹马、75头驴及100只牧羊犬脑组织中BDV-P24基因片段进行检测，阳性率依次为1.5%、5.3%、9.0%，而阳性标本检测BDV-P40则为阴性。贵州遵义地区蝙蝠BDV自然感染率较其他地方高，可能存在以下原因：①本次实验采用Western blotting法检测BDV核蛋白，其特异性较PCR高。研究[18]发现BDV-P40的转录水平较BDV-P24低，在基因片段复制过程中，BDV-P40所需模板量比BDV-P24高，故单纯采用PCR法检测BDV-P40基因片段可能会出现假阴性结果。②采样处于感染的不同时期对实验结果会造成影响。③BDV自然感染具有地域性及物种差异，可能贵州遵义地区蝙蝠BDV自然感染率较高。④不同取材部位和样本量的多少会影响实验结果。Nakamura等[19]对1例血BDV阳性精神分裂症患者不同部位的脑组织进行检测，发现在海马、小脑、脑桥中只能检测出BDV-P24，而在颞叶中只能检测出BDV-P40。此外，不同的实验室条件、实验室污染情况也会影响实验结果。

可见，贵州遵义地区蝙蝠存在BDV自然感染，蝙蝠有可能是BDV的自然宿主之一，人感染BDV可能存在潜在的动物源性。

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(收稿日期：2015-08-07)

中图分类号：R373

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)11-0023-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.11.008

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31160210)。