耐辐射奇球菌pprM基因回补株的构建与鉴定

付亮 何淑雅 潘宝平 曾洋 肖方竹 田帅 卢先州 黄波 马云

421001衡阳，南华大学公共卫生学院核辐射DNA损伤与修复实验室（付亮、何淑雅、潘宝平、曾洋、肖方竹、黄波），药学与生物科学学院生物化学与分子生物学教研室（田帅、马云）；421002衡阳，南华大学附属南华医院普外科（卢先州）

耐辐射奇球菌pprM基因回补株的构建与鉴定

付亮 何淑雅 潘宝平 曾洋 肖方竹 田帅 卢先州 黄波 马云

421001衡阳，南华大学公共卫生学院核辐射DNA损伤与修复实验室（付亮、何淑雅、潘宝平、曾洋、肖方竹、黄波），药学与生物科学学院生物化学与分子生物学教研室（田帅、马云）；421002衡阳，南华大学附属南华医院普外科（卢先州）

目的 构建耐辐射奇球菌pprM基因缺失回补菌株，为进一步研究PprM蛋白的功能奠定实验基础。方法 设计并合成HA-pprM基因（HA为流感病毒血凝素）全长的引物，以无突变的pGEX-6p-1-pprM载体为模板，PCR扩增出携带NdeⅠ酶切位点的HA-pprM基因全长，经NdeⅠ酶切后，与pRADK载体连接并转化大肠杆菌，经培养、提取质粒及纯化后，采用酶切鉴定以及基因测序方法确认插入序列的正确性；采用CaCl2法将构建好的重组质粒pRADK-HA-pprM转化到耐辐射奇球菌pprM基因缺失的菌株中，通过Western blot验证HA-PprM融合蛋白的表达。结果 构建的重组质粒pRADK-HA-pprM经NdeⅠ酶切鉴定结果符合目的条带大小（438 bp），测序结果显示插入的寡核苷酸序列及方向与预期的一致，Western blot结果显示HA-PprM融合蛋白的相对分子质量约为13 000。结论 笔者成功构建了重组质粒pRADK-HA-pprM，为进一步研究与PprM蛋白相互作用的靶DNA的筛选奠定了良好的基础。

奇异珠菌属；pprM基因；回补株构建

Fund program:National Natural Science Foundation ofChina（81272993）;Hunan Provincial Innovation Foundation for Postgraduate（CX2013B398）

耐辐射菌属（Deinococcus）是已发现的最耐辐射的微生物，是众所周知的能够耐受多重压力的球菌或杆状非孢子菌，其高效的DNA损伤修复的能力是已知的其他细菌无法比拟的[1]。耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans，DR）是由美国科学家Anderson等[2]于1956年在经X射线灭菌后仍然变质的牛肉罐头中首次发现的，其对电离辐射、紫外辐照、干燥以及其他造成DNA双链断裂的理化因素均具备超乎寻常的抵抗能力[3-4]。研究发现，pprI基因（pleiotropic gene promoting DNA repair）的功能是作为一个辐射响应调控的总开关[5]，而pprM基因可能是依赖于pprI基因的一个调节子，并证实pprM基因缺陷菌株表现出对电离辐射较高的敏感性[6]。通过对PprM蛋白进一步的生物信息学分析发现，该蛋白既含有RNA结合结构域，又拥有冷休克DNA结合域（cold-shock DNA-binding domain）。PprM蛋白同时拥有RNA和DNA结合的特性在已知的DR蛋白中是非常罕见的，提示该蛋白在DR辐射抗性方面可能起着重要的调控作用。但目前有关pprM基因功能的研究尚少，具体的调控途径仍不清楚。

本研究拟在前期构建的pprM基因敲除株的基础上，利用PCR方法在pprM基因的C末端携带HA（流感病毒血凝素）标签，并连接到pRADK质粒上，再转化到pprM基因敲除株中，得到pprM基因敲除回补株，为后期研究与PprM蛋白相互作用的靶DNA筛选奠定良好的基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

DeinococcusradioduransR1（编号：CGMCC1.633）由南华大学公共卫生学院核辐射DNA损伤与修复实验室传代并保存，购自中国普通微生物菌种保藏中心；pprM基因缺失株、大肠杆菌DH5α由南华大学公共卫生学院核辐射DNA损伤与修复实验室保存；pRADK质粒由浙江大学农业与生物技术学院华跃进教授馈赠。

1.2 主要试剂

限制性内切酶NdeⅠ、T4 DNA连接酶购自美国Fermentas公司；Pfx高保真DNA聚合酶购自美国nvitrogen公司；质粒提取试剂盒、PCR试剂盒、DNA Marker、抗HA标签兔多克隆抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；凝胶回收试剂盒购自美国Omega公司；引物合成、基因测序由苏州金唯智生物技术有限公司完成。

1.3 重组质粒pRADK-HA-pprM的构建

以无突变的pGEX-6p-1-pprM载体作为模板，设计并合成带HA标签的引物对，序列为P1：5′-GGGTATAC（NdeⅠ酶切位点）GTGTGCCGAGTTTC-3′；P2：5′-CTCATATG（NdeⅠ酶切位点）GGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGTA（HA标签序列）-CCAGCGGTCGTCGGG-3′。采用Pfx高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，反应体系见表1。扩增条件如下：94℃2 min；94℃45 s、59℃30 s、72℃90 s，共30个循环；72℃延伸10 min。

表1 PCR扩增的反应体系Table 1 PCR reaction system

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后进行切胶回收，按普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒中的说明进行回收和纯化。将获得的PCR产物送往苏州金唯智生物技术有限公司进行测序。提取质粒载体pRADK。将PCR产物与pRADK质粒用NdeⅠ酶切，酶切体系：PCR产物或pRADK质粒25 μl，10×buffer R 5 μl，NdeⅠ2 μl，加ddH2O至50 μl。酶切条件：37℃，水浴酶切3 h。将载体与目的片段的单酶切产物进行连接，连接体系：T4 DNA连接酶1 μl，10×Ligation Buffer 1 μl，pRADK质粒1 μl，HA-pprM4μl，加ddH2O至10μl。连接条件：16℃，过夜连接。取5μl的连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，于含30 μg/ml卡那霉素的LB平板上筛选。挑取平板上的单克隆菌落接种到5 ml含30 μg/ml卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜摇培，再提取质粒，质粒经NdeⅠ酶切验证，阳性克隆子送苏州金唯智生物技术有限公司测序。

1.4 DRpprM基因敲除回补株的构建及Westernblot鉴定

DR新鲜感受态细胞的制备和转化采用改良的CaCl2法[7]，简要操作步骤如下：挑取DR单菌落，接种于TGY液体培养基中，30℃振荡培养过夜以活化菌种；第2天取适量菌液转接于10 ml新鲜TGY（tryptone-glucose-yeast）液体培养基中，培养至OD值约0.8，然后分装到1.5 ml离心管中，每管1 ml，4℃，3500×g离心5 min收集菌体；加入1 ml无菌CaCl2溶液（配方：2×TGY培养基、50 mmol/L CaCl2溶液），4℃，3500×g离心5 min收集菌体，并重复一次。加入0.5 ml无菌CaCl2溶液，30℃振荡培养90 min；取出离心管至冰上冷却2 min，然后加入需要转化的质粒10μl，轻轻混匀后于冰上静置45 min；将离心管中的菌液转移至5 ml TGY液体培养基中，30℃振荡培养18h；取100μl菌液涂布于含30 μg/ml卡那霉素的营养肉汁固体培养基上。

挑取阳性克隆至5 ml含30 μg/ml卡那霉素的TGY液体培养基中，30℃振荡培养约20 h。采用生物辐照仪（中国核动力研究设计院设备制造厂）予以2 kGy辐照，收集细菌。加入5 ml新鲜TGY液体培养基，30℃振荡培养约2 h。将菌液置于冰上用美国Sonics超声波细胞破碎仪破碎，超声10 s，间歇10s，共超声30次，超声输出振幅15%。13000×g离心10min，吸取上清用于Westernblot检测。

2 结果

2.1 HA-pprM目的片段的电泳鉴定结果

利用上述1.3节中的方法进行PCR扩增，获得携带有NdeⅠ酶切位点的HA-pprM目的片段，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，在250 bp与500 bp之间有一条非常明显的条带，约为438 bp（图1）。与预期大小相符。

2.2 重组质粒pRADK-HA-pprM的酶切鉴定及测序结果

将重组质粒pRADK-HA-pprM进行NdeI单酶切，得到约438 bp的目的条带，如图2所示。将酶切鉴定成功的质粒送往苏州金唯智生物技术有限公司进行测序分析，结果如图3所示，所测得的序列通过Blast比对分析，结果表明HA-pprM片段插入位点正确，没有造成任何突变。

图1 PCR产物HA-pprM目的片段的琼脂糖凝胶电泳图图中，M：DNA分子量标准；1～4：PCR产物。Fig.1 PCR product fragment HA-pprM electrophoresis

图2 质粒pRADK-HA-pprM单酶切电泳图 图中，1：质粒DNA；2：NdeⅠ酶切产物；M：DNA分子量标准。Fig.2 Single enzyme digestion results of pRADK-HA-pprM

2.3 pprM基因在回补株中表达的Western blot鉴定结果

超声裂解转化成功的回补株菌体，提取总蛋白，并进行Western blot检测，结果得到相对分子质量约为13 000的蛋白质条带，与预期大小一致（图4）。

3 讨论

高剂量的电离辐射会导致基因组产生大量的DNA断裂片段，其中，DNA双链断裂被认为是最致命的伤害，尽管其发生率显著低于单链断裂和DNA碱基损伤。若电离辐射只损伤DNA的一条链（如单链断裂或DNA碱基损伤），可以使用未损坏的互补链作为模板进行修复，但若是双链断裂则很难找到模板进行无突变修复，因为DNA的两条链都不是完整的。然而基因组的完整性决定了细胞的存活状态，因此大多数研究的热点便是辐照期间损伤DNA的修复[8-9]。DR高效的DNA损伤修复能力可以重新精确组装损伤的DNA片段成完整的分子，参与DNA损伤修复途径的基因有很多，如RecA重组酶[10]（在诱导DNA双链断裂的修复中起核心作用）、PprA[11-12]（促进DNA修复多效性功能蛋白）、PprI[5，13]（耐辐射全局调控蛋白）、DdrO[14-15]（辐射干燥响应调节蛋白）等。pprM基因是随着对pprI基因的深入研究而发现的辐射响应相关基因，对这个新基因目前了解甚少，初步研究表明，pprM基因缺陷菌株对电离辐射较敏感[6]，且将pprM基因转入大肠杆菌能提高其抗盐碱、耐干旱的能力[16]。

图3 pRADK-HA-pprM重组质粒测序鉴定部分结果Fig.3 The sequencing result of pRADK-HA-pprM

图4 Western blot分析HA-pprM基因在回补株中的表达 图中，1：阳性对照；2：pprM基因缺失菌株；3：野生型菌株；4：pprM基因回补菌株。Fig.4 Expression of HA-pprM in complemented strain analyzed by Western blot

PprM作为一种冷激蛋白，在辐射诱导下高表达，其不可能单独发挥作用。研究虽已证明PprM是一种PprI依赖性DNA损伤应答的调节器，但很有可能还有其他因子发挥着直接或间接的调控作用。DR辐射调控网络一直是科研工作者们研究的热点，Lu等[17]对pprI基因进行染色质免疫沉淀技术分析，发现PprI蛋白能特异性结合pprA和recA等DNA修复基因的启动子，而且在电离辐射诱导下，结合活性得到加强。进一步通过基因芯片研究发现，PprI可与DR_0905、DR_0906序列结合并上调其表达。生物信息学分析发现，gyrB（DR_0906）位于pprM（DR_0907）的上游，与gyrA同属于DNA解旋酶基因。研究表明PprA除了促进DNA修复外，还能与DNA解旋酶、拓扑异构酶DraTopoIB协同作用，促进超螺旋DNA的松弛，共同维持DR基因组的完整性[12，18]。进一步对PprA相互作用的蛋白进行预测表明其与DNA解旋酶、PprI、RecA、DdrA等蛋白的关系非常密切[19]。启动子预测分析发现，pprM的启动子可能位于DR_0905、DR_0906序列位置之间，与DR_0906拥有共同的启动子。已有相关文献证明，pprM缺陷菌株中PprA的含量增加，辐照处理后与野生型菌株的PprA含量相同，说明PprM可能抑制pprA的表达，但经辐照后又可以去抑制[6]。笔者对PprM的DNA结合特性进行深入的生物信息学分析发现：①PprM可能结合PprA的启动子，通过调控PprA的表达，参与到DNA修复的多种途径中。②PprM可能结合DR_0906的启动子并调控其表达。故笔者可以大胆推测，PprI能够与pprA启动子结合并调控该基因的辐射抗性，同时PprM能够调控gyrB的表达，并与PprA、GyrA、DraTopoIB等协同作用以维持基因组的稳定。

本研究旨在筛选与PprM相互作用的靶DNA，鉴于PprM蛋白目前尚没有商业化的单克隆抗体，故设计并构建了带HA标签的pprM基因回补株，为后期实施染色质免疫沉淀技术奠定了扎实的基础。笔者所在课题组一直致力于pprM基因的深入研究，已完成筛选与PprM相互作用的靶RNA、酵母双杂交筛选与PprM相互作用的蛋白等研究（数据尚未发表）；本研究利用染色质免疫沉淀技术筛选与PprM相互作用的靶DNA，在辐射响应基因pprM调控网络的全面研究中迈进了重要一步。

利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明 马云、何淑雅、付亮负责研究命题的提出、设计；付亮、肖方竹、田帅负责实验的实施；黄波、卢先州负责数据的分析及后勤保障；付亮、何淑雅、马云负责论文的起草及最终版本修订。

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Construction and identification of pprM-complemented Deinococcus radiodurans strain

Fu Liang, He Shuya,Pan Baoping,Zeng Yang,Xiao Fangzhu,Tian Shuai,Lu Xianzhou,Huang Bo,Ma Yun
Nuclear DNA Damage and Repair Laboratory,School of Public Health,University of South China, Hengyang 421001,China（Fu L,He SY,Pan BP,Zeng Y,Xiao FZ,Huang B）;Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Pharmacy and Biological Sciences,University of South China,Hengyang 421001,China（Tian S,Ma Y）;Department of General Surgery,Nanhua Affiliated Hospital,University of South China（Lu XZ）

Ma Yun,Email：luckymayun@163.com

ObjectiveTo investigate the function of PprM protein by constructing a pprM-complemented strain of Deinococcus radiodurans.MethodsHA-pprM gene was amplified by PCR from the plasmid DNA of pGEX-6p-1-pprM(approximately 438 bp)and then inserted into the shuttle expression vector pRADK to construct pRADK-HA-pprM.The correctness of the inserted sequences was confirmed through agarose gel electrophoresis,restriction enzyme digestion,and gene sequencing.The recombinant plasmid was transformed into the pprM mutant strain of Deinococcus radiodurans,and the recombinant protein was analyzed by Western blot.ResultsThe recombinant plasmid pRADK-HA-pprM and a complemented strain were obtained.The recombinant protein can be highly expressed in the complemented strain.ConclusionThis study provided a foundation for further studies on the interaction between the PprM protein and its target DNA.

Deinococcus；pprM gene；Complemented strain construction

马云，Email：luckymayun@163.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.02.006

国家自然科学基金（81272993）；湖南省研究生科研创新项目（CX2013B398）

2016－02－16）