免疫诱导IRM-2小鼠再生障碍性贫血模型的研究

张丽娟 马蕊 王月英 李德冠

300192天津，中国医学科学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室

免疫诱导IRM-2小鼠再生障碍性贫血模型的研究

张丽娟 马蕊 王月英 李德冠

300192天津，中国医学科学院放射医学研究所，天津市放射医学与分子核医学重点实验室

目的 建立IRM-2小鼠再生障碍性贫血（AA）实验动物模型，并检测其血液及相关免疫学指标。方法 IRM-2小鼠经137Cs γ射线6 Gy照射后，输入DBA/2小鼠的胸腺细胞，建成免疫介导型AA模型。实验分3组，即对照组、照射组和AA模型组，于照射后第15天检测小鼠的血常规和免疫学指标。结果 IRM-2小鼠AA模型组外周血WBC、RBC、骨髓有核细胞数和网织红细胞百分比分别为（2.38±0.53）×109/L、（8.22±0.21）×1012/L、（7.14±1.19）×106/股骨和（50.2± 8.9）‰，均低于对照组 [（8.23±0.41）×109/L、（10.24±0.91）×1012/L、（16.5±1.61）×106/股骨和（76.2± 9.7）‰]；IRM-2小鼠AA模型组免疫学指标中CD4+细胞比例[（8.91±2.55）%]低于对照组[（16.14± 3.09）%]，CD8+细胞比例[（13.55±2.12）%]高于对照组[（6.83±1.14）%]。IRM-2小鼠AA模型组外周血及免疫学指标与对照组比较，差异均具有统计学意义。结论 IRM-2小鼠AA动物模型的建立，对AA的研究具有较好的应用价值。

贫血，再生障碍性；模型，动物；免疫诱导；评价研究

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81372928）;Natural Science Foundation of Tianjin（15JCZDJC35200）;Research Fund of Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences（1539）

再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）是一种骨髓造血功能衰竭症，是以全血细胞减少为主要表现的一种综合征[1]。近年来，对AA的机制研究已逐渐深入到分子生物学水平，动物模型的建立是研究其机制的基础。建立动物模型的方法主要包括物理、化学和免疫介导等，很多学者进行了多方面的探索和改进。本研究运用电离辐射及免疫介导在RM-2小鼠中建立AA小鼠模型，在此基础上对AA小鼠模型的全血细胞、网织红细胞（reticulocyte，Ret）、骨髓及免疫学指标进行了检测，为AA的发病机理、药物筛选及防治研究提供了较好的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物

DBA/2近交系小鼠，雄性，5只，体重22～24g，由中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK（京）2005-0013；IRM-2近交系小鼠由我所培育[2-3]，雄性，30只，体重22～24 g，合格证号：SCXK（津）2005-0001。

1.2 主要仪器与试剂

137Cs γ照射源（CAMMA-CELL40，加拿大原子能有限公司），照射剂量为6Gy，剂量率为0.84Gy/min；Coulter Ahra流式细胞仪购自美国Beckman公司；pocH-100i血细胞计数仪购自日本希森美康公司；RPMI-1640培养基、小牛血清均购自美国Gibco公司；异硫氰酸荧光素标记的兔抗鼠CD4抗体、藻红蛋白标记的兔抗鼠CD8抗体均购自美国Ebioscience公司。

1.3 分组与照射方法

将IRM-2小鼠按体重分为3组，即对照组、照射组、AA模型组，每组10只，每组小鼠平均体重差异不能大于1，从而尽可能减少每组小鼠的生物差异性。其中，照射组和AA模型组小鼠接受6.0 Gy37Cs γ射线一次性全身照射。

1.4 AA模型小鼠的建立

处死DBA/2小鼠，取出胸腺，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液进行研磨，过滤，制成细胞浓度为5×106个/ml的单细胞悬液，经眼静脉丛注入照射后的IRM-2小鼠体内，0.2 ml/只。对照组和照射组注入等量的RPMI-1640培养液。

1.5 外周血常规指标的测定

照射后15 d，通过小鼠眼球取血200 μl，用血细胞计数仪测量外周血WBC、RBC、血小板数和血红蛋白（hemoglobin，HGB）含量。

1.6 Ret及骨髓有核细胞（bone marrow nucleated cells，BMNC）计数

同1.5中的方法取血100 μl，用1%煌焦油蓝染色，在显微镜下计数Ret；取出小鼠单侧股骨，冲出骨髓，用血细胞计数仪测定BMNC。另取外周血，裂解红细胞后分别加入相应抗体进行避光孵育，用流式细胞仪检测 CD4、CD8、CD40、CD80/86、B220等指标。

1.7 统计学方法

所有数据处理采用SPSS16.0软件进行分析，统计结果以±s表示，两组比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AA模型小鼠外周血指标

AA模型小鼠外周血各指标计数结果见表1，由表可见，AA模型小鼠的WBC、RBC、HGB含量和血小板数均比对照组和照射组低，其中，与对照组和照射组比较，WBC、RBC和血小板数差异均有统计学意义（WBC：t=27.603、7.835，P均＜0.05；RBC：t=6.841、6.016，P均＜0.05；血小板：t=13.944、6.737，P均＜0.05）；与对照组比较，HGB含量差异有统计学意义（t=5.063，P＜0.05）。

2.2 AA模型小鼠BMNC和Ret

AA模型小鼠BMNC数和Ret百分比结果见表2，由表可见，AA模型小鼠BMNC数和Ret百分比均比对照组和照射组低，且差异有统计学意义（BMNC：t=15.867、2.773，P均＜0.05；Ret：t= 6.245、3.084，P均＜0.05）。

表1 AA模型小鼠外周血各指标计数（±s）Table 1 The counts of peripheral blood indexes in aplastic anemia model（±s）

表1 AA模型小鼠外周血各指标计数（±s）Table 1 The counts of peripheral blood indexes in aplastic anemia model（±s）

注：表中，AA：再生障碍性贫血；HGB：血红蛋白。

组别 只数对照组 10照射组 10 AA模型组 10 WBC（×109/L）血小板（×109/L）8.23±0.41 10.24±0.91 149.7±11.6 1216.4±78.1 4.82±0.83 9.83±0.82 132.1±12.1 996.2±132.1 2.38±0.53 8.22±0.21 121.2±13.5 635.1±106.2 RBC（×1012/L）HGB（g/L）

2.3 AA模型小鼠外周血免疫学分型

AA模型小鼠外周血免疫学分型结果见表3，由表可见，AA模型小鼠CD4+细胞比例低于对照组，差异有统计学意义（t=5.963，P＜0.05）；CD8+、CD40+、CD80+/86+细胞比例均高于对照组和照射组，且差异有统计学意义（CD8+：t=8.829、8.048，P均＜0.05；CD40+：t=10.767、11.072，P均＜0.05；CD80+/86+：t=6.988、9.241，P均＜0.05）；B220+细胞比例高于对照组，差异有统计学意义（t=2.172，P＜0.05）；CD4+/CD8+值低于对照组和照射组，差异有统计学意义（t=5.085、3.718，P均＜0.05）。

表2 AA模型小鼠骨髓有核细胞数和网织红细胞百分比（±s）Table 2 The count of BMNC and percentage of Ret in aplastic anemia model（±s）

表2 AA模型小鼠骨髓有核细胞数和网织红细胞百分比（±s）Table 2 The count of BMNC and percentage of Ret in aplastic anemia model（±s）

组别 只数对照组 10照射组 10 AA模型组 10 BMNC（×106/股骨） Ret（‰）16.5±1.61 76.2±9.7 9.28±2.13 59.8±4.2 7.14±1.19 50.2±8.9

3 讨论

AA是一类以造血组织功能衰竭为特征的综合征[1，4-5]，主要表现为骨髓造血功能低下及外周血全血细胞减少，AA具有治愈难、病势延缓的特点，目前认为该病的主要发病机制为造血干细胞减少或缺损、造血微环境损伤以及T淋巴细胞功能亢进。针对不同发病机制，建立AA动物模型，对于深入研究AA发病机制和选择有效的治疗靶点具有重要的临床意义。目前，先天性AA动物模型，诸如Fanc A-/-、Fanc C-/-、Fanc G-/-、Fanc D1-/-/Fanc 2-/-、Fanc D2-/-等小鼠及其他基因缺陷小鼠的AA模型较多[6]，而用电离辐射及免疫介导方法建立AA模型小鼠较少，本研究用该方法成功建立了AA模型小鼠。目前对AA动物模型评价的主要指标包括：全血细胞、Ret和骨髓象三系血细胞[1，4]，本研究对AA模型小鼠全血细胞、Ret、BMNC的检测结果表明，AA模型组小鼠WBC、RBC、血小板数和HGB含量均低于对照组和照射组，BMNC数及Ret百分比显著下降，与对照组和照射组比较差异有统计学意义。本研究建立的AA模型小鼠，其外周血常规、Ret百分比和BMNC数等指标均符合AA动物模型的要求，与临床AA患者各项指标相符或相近，证明了本研究建立的AA动物模型是成功的。AA的发病机理除与造血干细胞本身缺陷、造血微环境损伤有关外，免疫功能异常也是一个重要的因素。CD4+细胞是具有辅助诱导性的T细胞亚群（Th），其增多表示B细胞产生的免疫球蛋白增多及细胞免疫力增强，CD8+是抑制性T细胞（Ts）中的细胞毒性T细胞（Tc）亚群，其增多表示免疫抑制；CD4+/CD8+值表示Th与Ts之间的功能平衡状态，是人体免疫系统内环境稳定的重要指标，该比值降低可引起机体免疫功能紊乱。AA患者的外周血CD4+细胞比例降低，CD8+细胞比例升高，CD4+/ CD8+值失调；本研究结果表明，AA模型小鼠CD4+细胞比例低于对照组，CD8+细胞比例高于对照组，CD4+/CD8+值失调，这与临床上AA患者的情况基本相符[5-6]。T细胞活化相关的共刺激分子CD40+、CD80+/86+等也参与了AA的发病过程，CD40+属于肿瘤坏死因子受体超家族，其表达异常是AA患者免疫功能紊乱的原因之一；CD80+/86+分子表达于抗原提呈细胞上，并介导了对AA患者造血机能的破坏。本研究中AA模型小鼠CD40+、CD80+/86+细胞比例高于对照组和照射组，表明体液免疫和细胞免疫都可能增强并参与AA的发生，这与临床对AA患者的研究结果相符[7-9]，从结果可以看出，本研究建立的AA模型小鼠的BMNC数、Ret百分比、外周血及分型等指标的变化与人类AA患者各项指标相符或相近，说明本研究成功构建了AA动物模型，对AA的研究具有较好的应用价值。

表3 AA模型小鼠外周血淋巴细胞亚群比例（±s）Table 3 The percentage of lymphocyte subsets in peripheral blood in aplastic anemia model（±s）

表3 AA模型小鼠外周血淋巴细胞亚群比例（±s）Table 3 The percentage of lymphocyte subsets in peripheral blood in aplastic anemia model（±s）

注：表中，AA：再生障碍性贫血。

组别 只数对照组 10照射组 10 AA模型组 10 CD80+/86+（%）16.14±3.09 21.12±6.06 10.36±6.22 15.38±6.35 8.91±2.55 36.64±3.55 CD4+（%）CD8+（%） B220+（%） CD4+/CD8+值 CD40+（%）6.83±1.14 33.86±6.39 2.51±0.91 13.33±1.36 7.14±1.36 41.78±8.26 1.82±0.87 11.26±2.12 13.55±2.12 40.31±6.88 0.73±0.32 20.93±1.77

利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明 张丽娟、马蕊、王月英负责方法建立、现场实验、论文撰写等工作；李德冠负责方法建立、论文审阅等工作。

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Immune-induced aplastic anemia IRM-2 mice model research

Zhang Lijuan,Ma Rui,Wang Yueying,Li Deguan
Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences,Tianjin 300192,China

Li Deguan,Email：lideguan@irm-cams.ac.cn

ObjectiveTo perform traditional blood and immunologic examinations for the pathogenesis of immune-induced aplastic anemia（AA）IRM-2 mice model.MethodsIRM-2 mice were divided into three groups,namely,the control,radiation,and AA model groups.IRM-2 inbred mice in the AA model group were used to set up the AA model by whole body137Cs γ irradiation and eye venous plexus injection with DBA/2 mice thymus cells.After 15 days of radiation,blood and bone marrow cells were counted,and immunologic detection was performed.ResultsThe peripheral WBC,RBC,bone marrow cells,and reticulocyte[（2.38±0.53）×109/L,（8.22±0.21）×1012/L,（7.14±1.19）×106/femur,and（50.2± 8.9）‰]in the AA model group were lower than those of the control group [（8.23±0.41）×109/L,（10.24± 0.91）×1012/L,（16.5±1.61）×106/femur,and（76.2±9.7）‰].CD4+cells[（8.91±2.55）%]of the AA model group were lower than those of the control group[（16.14±3.09）%],whereas CD8+cells[（13.55±2.12）%] were higher than those of the control group[（6.83±1.14）%].Peripheral blood and immunological indexes of the AA model group were statistically different from those of the control group.ConclusionIRM-2 mice AA model was successfully established as a good model for the study of AA.

Anemia,aplastic;Models,animal;Immune induction;Evaluation studies

李德冠，Email：lideguan@irm-cams.ac.cn

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.02.008

国家自然科学基金（81372928）；天津市重点基金（15JCZDJC35200）；中国医学科学院放射医学研究所开发基金（1539）

2016-01-06）