制川贝母质量标准研究

林莉，刘奇

·品种品质·

制川贝母质量标准研究

林莉1，刘奇2

目的：建立制川贝母的质量标准。方法：参照2010年版《中国药典》川贝母质量标准中相关方法，建立制川贝母显微鉴别、薄层鉴别、水分测定、总灰分测定、浸出物测定，以西贝母碱为指标的总生物碱含量项目的检查方法并规定限度，采用HPLC法建立制川贝母中贝母辛含量测定方法并拟定含量限度，以此对制川贝母进行质量标准研究。结果：川贝母炮制前后显微鉴别特征变化不大，薄层鉴别显示炮制品和生品提取物没有太大差别，制川贝母的水分不应超过13.0%，总灰分不得超过1.60%，浸出物不得少于25.0 %，总生物碱含量以西贝母碱计不得少于0.04%，贝母辛含量不得少于0.02%。结论：本研究可为制川贝母的质量标准的建立提供参考。

制川贝母；总生物碱；贝母辛；质量标准

川贝母系川产道地贵细药材，主产于四川、云南、西藏、青海、陕西等地区，贝母属植物约有130种，我国约有30余种[1～2]。据《中国药典》2010 版一部中川贝母收载有六种基源种，为百合科植物川贝母Fritillaria cirrhosa D.Don、暗紫贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia、甘肃贝母Fritillaria przewalskii Maxim.、梭砂贝母Fritillaria delavayi Franch.、太白贝母Fritillaria taipaiensis P.Y.Li或瓦布贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K.C.Hsia var. wabuensis (S. Y. Tang et S.C.Yue)Z.D.Liu,S.Wang et S.C.Chen的干燥鳞茎。性苦、甘、微寒，归肺、心经。主治肺热燥咳，干咳少痰，阴虚劳嗽，咯痰带血，瘰疬、乳痈、肺痈[3]，现代药理研究表明，贝母还具有抗菌、镇静、镇痛、抗溃疡、抗肿瘤等多种功效[4]。川贝母主要含生物碱、多糖、皂苷等成分，其中生物碱是川贝母的主要活性成分[5～7]，《中国药典》2010 版一部中川贝母六种基源种之间生物碱成分差别较大，其中西贝母碱、贝母辛、贝母素甲、贝母素乙是六中基源种共有成分[8]。

川贝母现已被制成中药方剂或中成药制剂，如蛇胆川贝露、川贝枇杷露等，可增强治疗疾病的效果，主要用于急性气管炎、支气管炎、肺结核等病症。本文研究的制川贝母是采用蜂蜜和雪梨汁、川贝母所制[9]，为保证制川贝母的用药安全，保证临床疗效，必须建立严格规范的质量标准。本研究按照《中国药典》2010 版一部川贝母项下标准，并新增了贝母辛的含量测定，对制川贝母质量进行了研究，以期为其质量评价和控制提供相关依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DM2500光学显微镜（德国徕卡Leica仪器有限公司）；CPA225D电子天平（赛多利斯科学仪器北京有限公司）；A580型双光束紫外可见分光光度计（翱艺仪器上海有限公司）、LC-20AT岛津高效液相色谱仪(日本岛津科技有限公司)、RE-5203旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司）、DZKW-4电子恒温水浴锅(北京中兴伟业仪器有限公司)

1.2 试药

制川贝母由四川藏域川贝生物研究中心有限公司提供[9]（批号：140603、140605、140608、140610、140615、140622、140701、140702、140706、140711、140725、140801）；川贝母对照药材，经成都中医药大学马云桐教授鉴定为百合科暗紫贝母Fritillaria unibracteata Hsiao et K. C. Hsia的干燥鳞茎，符合《中国药典》2010版一部川贝母项下各项规定。贝母素乙对照品，购自中国食品药品检定研究院（Peiminine ，批号：110751-201110 ID：4D1S-ZK7Y 供含量测定用，含量99.9%）；西贝母碱对照品，购于中国食品药品检定研究院（Sipeimine，批号：110767-201208 ID：R3WR-Q508，供含量测定用，含量99.1%）；贝母辛对照品，购自成都普菲德生物技术有限公司（Peimisine，批号：131202，含量≥98%）；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）、三氯甲烷（四川西陇化工有限公司）、氨水(分析纯，成都市科龙化工试剂厂)、甲醇（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）、溴甲酚绿、氢氧化钠、磷酸二氢钾（试剂均购自成都市科龙化工仪器厂）

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

取供试品（批号：140605）粉末过四号筛，挑取少许置载玻片上，滴加水合氯醛试液1-2滴，在酒精灯上加热透化，并滴加稀甘油，盖上盖玻片，置显微镜下观察。见图1，结果显示，制川贝淀粉粒甚多，广卵形、长圆形或不规则圆形，有的边缘不平整略作分枝状，脐点短缝状、点状、人字状或马蹄状，层纹隐约可见，未见表皮细胞及螺纹导管。

图1 制川贝显微图

2.2 薄层鉴别

取供试品（批号：140605）粉末10.0 g，加浓氨试液10 mL，密塞，浸泡1 h，加二氯甲烷40 mL，超声处理1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。取川贝母对照药材粉末10.0 g，加浓氨试液10 mL，密塞，浸泡1 h，加二氯甲烷40 mL，超声处理1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇0.5 mL使溶解，作为对照药材溶液溶液；另取贝母素乙对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010版一部附录附录VI B）试验，吸取对照品溶液2 µL，供试品溶液6 µL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-浓氨试液-水（18∶2∶1∶0.1）为展开剂，展开，取出，晾干；依次喷以稀碘化铋钾和亚硝酸钠乙醇试液。如图2，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色斑点，即制川贝能检出贝母素乙，故收入标准正文。见图2。

1 贝母素乙对照，2 川贝母对照药材，3 供试品图2 制川贝薄层色谱图

2.3 水分测定

制川贝母水分按照《中国药典》2010 版（附录IX H 第一法）进行测定，结果见表1．根据测定结果制川贝母水分含量为7.7924%～9.8264%，平均为9.16%，并规定本制川贝母水分不得超过13.0%。

2.4 总灰分测定

制川贝母总灰分按照《中国药典》2010 版（附录IX K）进行测定，结果见表1。根据测定结果，制川贝母总灰分为1.22%～1.46%，平均为1.32%，并规定本制川贝母总灰分不得超过1.60%。

2.5 浸出物测定

制川贝母浸出物照醇溶性浸出物测定法《中国药典》2010 版（附录X A）项下的热浸法测定，结果见表1。根据测定结果，制川贝母浸出物测定结果为23.83%～33.44%，平均为30.86%，并规定本制川贝母浸出物不少于25.0%。

表1 制川贝母水分、总灰分、浸出物测定结果（n=3）

2.6 西贝母碱含量测定[10]

2.6.1 对照品溶液的制备 取西贝母碱对照品1.95 mg，精密称定，加三氯甲烷制成0.195 mg·mL-1的溶液。

2.6.2 供试品溶液的制备 取制川贝粉末（过三号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液3 mL，浸润1小时。加三氯甲烷-甲醇(4:1)混合溶液40 mL，置80 ℃水浴加热回流2小时，放冷，滤过，滤液置50 mL量瓶中，用适量三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液至刻度，摇匀。精密量取4 mL置25 mL具塞试管中，水浴上蒸干，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解，精密加水5 mL，再精密加0.05%溴甲酚绿缓冲液(取溴甲酚绿0.05 g，用0.2 mol·L-1氢氧化钠溶液6 mL使溶解，加磷酸二氢钾1 g，加水使溶解并稀释至100 mL，即得)2 mL，密塞，剧烈振摇，转移至分液漏斗中，放置30分钟。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.6.3 测定波长的选择 吸取西贝母碱对照品溶液0.6 mL，补加三氯甲烷至10.0 mL，照“2.6.2”项下，自“精密加水5 mL”起依法制备，置于紫外可见分光光度计下，以相应的试剂为空白，在330～600 nm范围内进行扫描，测得最大波长为415 nm。

2.6.4 标准曲线的制备 精密量取西贝母碱对照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL，置25 mL具塞试管中，精密加入三氯甲烷10 mL使溶解,自“精密加水5 mL”起依法制备供试品溶液，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(附录V A)，在415 nm波长处测定吸光度。以浓度为横坐标x，吸光度为纵坐标y，绘制标准曲线，得回归方程y=1.811x-0.004，R2=0.9997（n=6），结果表明西贝母碱质量浓度在0.0209～0.4187 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.6.5 精密度试验 精密量取“2.6.1”项下西贝母碱对照品溶液0.6 mL，按“2.6.4”项操作，平行测定吸光度值6次，其RSD（n=6）为1.55%，结果表明，本方法精密度较好。

2.6.6 重复性试验 精密称定供试品（批号：140605）6份，每份2 g，按“2.6.2”项下方法制成供试品溶液，以相应的试剂为空白，在415 nm处测定吸光度，其RSD （n=6）为2.0 %，结果表明，本方法重复性较好。

2.6.7 稳定性试验 精密称定供试品（批号：140605）

2 g，按“2.6.2”下方法制成供试品溶液，以相应的试剂为空白，在时间间隔为0、15、30、45、60、75、90 min时在415 nm处测定吸光度，RSD为0.91%，结果表明在90 min内稳定性良好。

2.6.8 加样回收试验 精密称定已知量的供试品（批号：140605）6份，约1 g，置25 mL具塞锥形瓶中，分别加入0.195 mg·mL-1的西贝母碱对照品溶液2.5 mL，按“2.6.2”项下方法制成供试品溶液，在415 nm处测定吸光度，计算回收率及相对标准偏差，由表2可知平均回收率为98.49%，RSD为2.01%，表明实验结果可信。

表2 制贝母中西贝母碱回收率试验结果（n=9）

2.6.9 制川贝母中西贝母碱含量测定

将10批样品按“2.6.2”项下制成供试品溶液，平行制备3份，在415 nm处测定其吸光度，根据“2.6.4”项下标准曲线回归方程，测定西贝母碱含量，结果见表3。并规定，本品按干燥品计算，含总生物碱以西贝母碱(C27H43NO3)计，不得少于0.040%。

表3 制川贝母中西贝母碱含量测定试验结果(n=12)

2.7 贝母辛含量测定

2.7.1 对照品溶液的制备 精密称取贝母辛对照品9.61 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇制成1.922 mg·mL-1的对照品储备液。再精密吸取对照品储备液溶液0.625 mL，加甲醇稀释成10 mL，即得对照品溶液。

2.7.2 供试品溶液的制备 取供试品5.0 g，置于250 mL圆底烧瓶中，加浓氨水10 mL，浸润2 h，加入三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液150 mL，混匀，置70 ℃水浴加热回流3 h，放冷，滤过，用适量三氯甲烷-甲醇(4∶1)混合溶液洗涤药渣2～3次，合并滤液与洗液置于50 ℃旋转蒸发至干，残渣加甲醇溶解并定容至2 mL容量瓶中，摇匀，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。2.7.3 色谱条件 采用Agilent Eclipse XDB- C18(5 μm×4.6 mm×250 mm)色谱柱；流动相为乙腈-0.02%三乙胺水溶液（30∶70），等度洗脱；检测波长为205 nm；流速为1.0 mL·min-1；进样量10 μL；柱温箱30 ℃。取空白溶剂、2.7.1项下对照品溶液、2.72项下供试品溶液，按以上色谱条件进行测定，见图1，结果显示贝母辛峰型良好，且色谱峰附近不存在干扰物质。

图3 贝母辛对照品(A)及制贝母样品（B）色谱行为/1. 贝母辛

2.7.4 线性关系考察 精密量取“2.7.1”项下对照品储备液适量，依次稀释成1、2、4、8、16、32、64、128倍，按“2.7.3”项下色谱条件测定，以贝母辛峰面积为纵坐标y，贝母辛浓度为横坐标x，得回归方程y=1E+07x-5947.8，R2=0.9982（n=8）。结果表明贝母辛质量浓度在0.015～1.922 mg·mL-1范围内线性关系良好。

2.7.5 精密度试验 精密吸取贝母辛对照品溶液10 μL，按“2.7.3”项下色谱条件测定，连续进样6次，测得的贝母辛的峰面积，计算贝母辛的RSD（n=6）为1.66 %，结果表明仪器精密度良好。

2.7.6 重复性试验 精密称定供试品（批号：140605）6份，每份5.0 g，照“2.7.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.7.3”项下色谱条件，进样10 μL，测得贝母辛的峰面积，计算贝母辛的RSD（n=6）为1.85%，表明本法重现性好，方法可行。

2.7.7 稳定性试验 精密称定供试品（批号：140605）5.0 g，按“2.7.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.7.3”项下色谱条件，分别于0、12、24、28、32、40 h后进样，测得贝母辛的峰面积，计算贝母辛RSD（n=6）为1.86%，表明供试品溶液在40 h内稳定性良好。

2.7.8 加样回收试验 精密称定供试品（批号：140605）6份，每份5.0 g，分别置于250 mL圆底烧瓶中，同时加入1 mL浓度分别为0.1105 mg·mL-1贝母辛对照品溶液，按“2.7.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.7.3”项下色谱条件测定，见表4，结果表明制贝母加样回收率试验符合要求。

表4 制贝母中贝母辛回收率试验结果（n=6）

2.7.9 制川贝母中贝母辛含量测定

将10批次供试品，按“2.7.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.7.3”项下色谱条件，见表5，根据测定结果，制川贝中贝母辛含量为0.024%～0.047%，平均为0.031%，故暂定制川贝，含贝母辛(C27H41NO3)不得少于0.020%。

表5 贝母辛含量测定试验结果（n=12）

3 讨论

川贝母为名贵的川产道地药材，常生长在海拔3500～4500 m区域[11]，生长周期长，加之近几年过度采挖，导致野生川贝母资源日渐匮乏，已被列入国家三级保护植物名单，且货源紧缺，价格昂贵，仅能满足5%～10%的市场需求[12]。本课题前期研究表明，经过秘制处理的川贝母口感更好，便于服用，增强了其清热润肺、化痰止咳的功效[9]，扩大了其临床用药范围，对提高川贝母的利用价值具有重要意义。生物碱作为贝母公认的有效成分之一，一直被用作贝母品质评价的内在标准[13]。贝母辛是《中国药典》2010 版一部中川贝母六种基源种的共有生物碱成分之一[14]，也是贝母的主要活性成分和特征性成分[15]。本文将贝母辛纳入制川贝母的质量标准研究，可加强对制川贝母的质量控制。经本文测定，水分、总灰分、浸出物限度制定均高于药典中川贝母对映项下标准，总生物碱以西贝母碱计比生品具有一定程度降低。综上，除西贝母碱含量测定外，本质量标准的各项要求及结果均在《中国药典》规定的川贝母质量标准范围内，并新增了贝母辛的含量测定。本研究制定的质量标准对制川贝母新工艺规范化、标准化起到重要指导作用，同时可作为控制制川贝母的质量依据。

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（责任编辑：陈思敏）

Quality standard of prepared Chuan Beimu

/LIN Li1, LIU Qi2/ / (1.Sichuan Provincial People’s Hospital , Chengdu 610021, Sichuan ;2. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine , Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: To establish the quality standard of prepared Chuan Beimu. Method: According to the methods recorded in Chinese Pharmacopeia (2010 edition) for the quality standard for prepared Chuan Beimu, the microscopic identification, TLC identifcation, the moisture content, ash content, extract and content determination of total alkaloids with imperialine as indicator were carried out. In addition, peimisine content of prepared Chuan Beimu was detected by HPLC. The limitations of total alkaloids and peimisine were made for the quality standard for prepared Chuan Beimu. Result: The thin layer identifcation showed that there were no significant difference of microscopic characteristics between processed product and raw product of Chuan Beimu. TLC identifcation of extract of processed product and raw product of Chuan Beimu was almost the same. The moisture content should be below 13.0%, and the total ash content should be less than 1.60%. The content of extract, total alkaloids calculated using imperialine as indicator and peimisine content of prepared Chuan Beimus should be more than 25.0 %, 0.04%, 0.020%, respectively. Conclusion: The research can be used as the reference for quality standard of prepared Chuan Beimu.

Prepared Chuan Beimu; total alkaloids; peimisine; quality standard

R 285.5

A

1674-926X(2016)06-002-05

四川省2015年中药炮制饮片规范

1. 四川省人民医院 四川 成都 6100211;

2.成都中医药大学药学院 四川 成都 610075

刘莉，主管药师，主要从事中药饮片质量及管理工作 Tel:13981922472

2016-04-05