人参果蔬酵素中人参皂甙含量的测定

陈书华，姜旭，张念洁（.延边朝鲜族自治州产品质量检验所，吉林延吉33000；2.北京泽优医药科技有限公司，北京00000）



人参果蔬酵素中人参皂甙含量的测定

陈书华1，姜旭2，*，张念洁1
（1.延边朝鲜族自治州产品质量检验所，吉林延吉133000；2.北京泽优医药科技有限公司，北京100000）

摘要：建立高效液相法色谱测定人参果蔬酵素中的人参皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量，用于评价产品的优劣。色谱条件：DiamonsilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相为乙腈与0.05 mol/L磷酸二氢钾水溶液，流速1 mL/min，梯度洗脱检测波长为203nm。该方法对人参皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd具有良好的线性，相关系数在

0.9993～0.9999之间；重复性和精密度良好，样品加标回收率在92.00%～101.50%之间。RSD小于5%；检出限低。该方法线性范围广，准确性和精密度良好，操作较简便，结果满意，能满足日常检验要求。

关键词：人参果蔬酵素；人参皂甙；高效液相色谱

微生物酵素是以一种或多种新鲜蔬菜、水果、菌菇、中草药等为原料，经多种有益菌发酵而产生的，含有丰富的维生素、酶、矿物质和次生代谢产物等营养成分的功能性微生物发酵产品。微生物酵素不但保存了发酵原料中所固有的营养物质，而且有不少有效成分大量增加，并产生了一些新的生物活性成分和生物酶[1]。研究证明：免疫系统是人机体内一个重要的感受和调节系统，益生菌和各种酶（酵素）使免疫细胞固有的识别和记忆功能正常。当免疫细胞因为识别和记忆发生障碍，攻击和损伤正常细胞组织时，会发生自身免疫疾病。如I型胰岛素依赖糖尿病，可能就是免疫细胞对胰腺中B细胞进行破坏，控制血糖胰岛素的分泌减少，补充人参果蔬酵素调节免疫细胞的功能，提高免疫细胞的识别能力，使免疫功能逐步的恢复到动态平衡，进而达到对治疗糖尿病的辅助治疗的作用。

人参果蔬酵素是由人参、蔬菜和水果为原料，经过科学的生物转化技术精制而成的纯天然的植物饮料，营养完整的酵素是萃取自人参及多种天然果蔬植物精华，再以植入有益菌种转化成熟的全机能性天然食品，富含多种维生素、矿物质和人体必需的氨基酸等，从中医上讲人参果蔬酵素具有补肝肾、益气血、生津液、调节各个脏腑功能正常的作用。它对维护血管健康、强化微血管弹性有一定的作用。可作为高血压、血管硬化、心脏疾病之辅助调养的食物，同时对预防肿瘤、抗衰老、抗心律失常、抑制细胞凋亡、降糖降脂、改善记忆、增强性功能和免疫功能及解酒等方面均有疗效。人参果蔬酵素中含有人参皂甙、人参醇、人参多糖、挥发油、低分子肽、氨基酸、维生素及其有机酸和多种微量元素等多种成分，同时对于发酵液来说，发酵过程中破坏了细胞组织，有利于有效成分的浸出。对于判定该物质的优劣，主要是从测定人参皂甙的含量来确定，人参皂甙主要包括有Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd等。含量测定方法有比色法[2]、薄层色谱法[3]、高效液相法[4]、超高速液相法[5]等。本文采用反相高效液相色谱法对人参果蔬酵素中人参皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量进行了测定。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

KQ-100B超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司；1260 infinity高效液相色谱仪：美国安捷伦有限公司；Milli-Q Advantage Merck Millipore纯水机：Merck Millipore USA；201s赛多利斯电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司。

人参皂甙Rg1（批号AB421G）、人参皂甙Re（批号AB240G）、人参皂甙Rb1（批号AB120G）、人参皂甙Rb2（批号AB235G）、人参皂甙Rc（批号AB237G）、人参皂甙Rd（批号AB763G），以上标准品含量＞98 %：天津一方科技有限公司；乙腈、甲醇为HPLC级别：sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2色谱分析条件[6]

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈与0.05 mol/L磷酸二氢钾水，流动相组成见表1；流速：1 mL/min；紫外检测波长：203 nm；进样量：20 μL；柱温：室温。洗脱溶剂梯度见表1。

表1　洗脱溶剂梯度表Table 1 The gradient of elution solvent

高效液相色谱图见图1。

1.3对照品的制备

精密称取人参皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd对照品，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解稀释至刻度，超声10min，得人参皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd对照品溶液作为储备液，用0.25 μm针头式滤膜过滤，初滤液弃去，续滤液备用。

1.4样品的前处理

精密称取人参果蔬酵素溶液20.00 g，加入甲醇置75℃水浴回流1 h，冷却后加正丁醇提取3次，浓缩至近干，加入甲醇定容5 mL。用0.25 μm针头式滤膜，初滤液弃去，续滤液进样进行液相色谱测定。

2　结果与讨论

2.1线性方程、方法检测限和精密度

标准曲线的制备精密吸取人参皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd对照品2.0、4.0、6.0、8.0 mL分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别吸取20 μL，注入液相色谱仪，按照1.2项下的方法测定，取其中一个混合标准溶液重复测定6次，以峰面积与质量浓度进行一元线性回归分析，计算峰面积的相对标准偏差，进行线性关系、线性范围、检测限和精密度的测定。6种人参皂甙在较宽的浓度范围内均具有良好地线性、相关系数都大于0.99，检测限较低，精密度较好，标准较好，见表2所示，最低检出线以信噪比为3∶1计算。

表2　人参皂苷工作曲线、线性、检测限和精密度（n=6）Table2 Theworkingcurve，linearities，detectionlimitsand RSD% of standard samples of ginsenosides（n=6）

2.2稳定性试验

样品溶液，按照1.2的方法在0、2、4、8、16、24 h分别进样20 μL，测定峰面积，结果人参Rg1+ Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd，表明样品溶液在24 h内保持稳定。见表3所示。

表3　人参皂苷稳定性试验Table 3 Stability experiments of ginsenosides

2.3重复性试验

取同一批人参果蔬酵素样品6份，按1.2的方法测定峰面积，见表4所示，相对标准偏差在2 %以内。

表4　人参皂甙重复性试验Table 4 Repeated experiment of ginsenosides

2.4加样回收率试验

精密称取人参果蔬酵素样品20 g，分别加入一定量的（3个梯度浓度）人参皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd混合对照品溶液，按1.4的制备方法及1.2的条件方法进行测定，进样分析，每个平行样6次平行测定，计算其回收率。结果表明，平均回收率92.00 %～101.50 %之间。见表5所示。

表5　人参皂苷加样回收率的试验结果（n=6）Table 5 Results of recovery ratio of ginsenosides（n=6）

2.7样品的含量测定

取按照1.4的方法处理得到的样品处理液，按照1.2的下的方法测定，人参果蔬酵素样品中含人参皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量见表6所示。

表6　样品中人参皂苷的含量（n=6）Table 6 The contents of in samples of ginsenosides（n=6）

3　结论

1）在样品前处理的过程中经过多种试验方法的比较，最终选择该前处理方法，由于样品剂型为果蔬酵素溶液，先用甲醇溶解去除样品中的一些杂质及蛋白质，冷却后加正丁醇提取3次，提取溶液中的皂甙成分。经试验对比，该提取方法简单易行，回收率高。

2）液相检测方法经过多种试验方法的比较，同时测出样品中的人参果蔬酵素中人参皂甙Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd的含量，本方法分离效果好，快速灵敏，稳定。可以根据人参皂甙的含量来评价酵素的优劣，为评价提供依据。

3）最近十几年来微生态、酵素[7]水解被应用到食品提取这个领域中来，采用酵素水解技术和生物发酵技术的处理更好的提高样品的含量，此产品前处理简单，易提取，这次试验的结果为以后的制备人参皂苷制品及酵素制品提供了一定的参考价值。

参考文献：

[1]蒋增良.天然微生物酵素发酵机理、代谢过程及生物活性研究[D].杭州:浙江理工大学,2013

[2]吴和珍,李婷婷,李菁,等.高效液相色谱法测定益智宁颗粒中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的含量[J].现代药物与临床,2012(4):25-27

[3]桂双英,周亚球.比色法测定人参中人参总皂苷的含量[J].安徽中医学报,2003(4):51-52

[4]刘志,阮长春,刘天志,等.HPLC法同时测定林下参、鲜人参、生晒参和红参中14种人参皂苷[J].中草药,2012,43(12):2431-2434

[5]毕晓黎.超高速液相测定西洋参中人参皂苷Rg1、Re、Rb1的含量研究[J].中国药师,2012,15(5):651-652

[6]刘连新,刘郁,时光霞,等.液相色谱测定葡萄酒中白藜芦醇含量的方法研究[J].食品研究与开发,2014,35(21):103-105

[7]张念洁,曲新砉,刘洪亮.人参和酶解人参中的人参二醇和人参三醇的含量比较[J].食品研究与开发,2015,36(6):28-31

Determination of Panaxoside in Enzyme of Ginseng and Fruit and Vegetable by HPLC

CHEN Shu-hua1，JIANG Xu2，*，ZHANG Nian-jie1
（1.Yanbian State Product Inspection，Yanji 133000，Jilin，China；2.Beijing Zeyou Medeicine Technologies Co.，Ltd.，Beijing 100000，China）

Abstract：To determine the content of panaxosides，such as Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd in enzyme of ginseng and fruit and vegetable，to evaluate the quality of the products，the HPLC method was established.Chromatographic conditions：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）chromatographic column，flow phase for acetonitrile and 0.05 mol/L KH2PO4aqueous solution，flow rate was 1 mL/min，gradient elution detection wavelength at 203 nm.The method had good linear correlation coefficient Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd and the correlation coefficient was between 0.999 3 and 0.999 9.The recovery rate was between 92 % and 101.50 %.RSD was less than 5 %，the detection limit was low.The method has a wide linear range，good accuracy and precision，the operation is simple，the results are satisfactory，can meet the daily inspection requirements.

Key words：enzyme of ginseng and fruit and vegetable；panaxosides；HPLC

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.027

作者简介：陈书华（1968—），男（汉），工程师，本科，研究方向：产品质量检测。

*通信作者：姜旭（1977—），女（汉），工程师，研究生，研究方向：食品质量分析。

收稿日期：2015-11-02