鹰嘴豆水提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

赵堂彦，孟茜，王琴，张奇波，陈霞，黄玉军，陈大卫，顾瑞霞，*（.扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏扬州57；.新疆克拉玛依农牧业科学技术研究所，新疆克拉玛依834000）



鹰嘴豆水提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究

赵堂彦1，孟茜1，王琴2，张奇波2，陈霞2，黄玉军2，陈大卫2，顾瑞霞1，*
（1.扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室，江苏扬州225127；2.新疆克拉玛依农牧业科学技术研究所，新疆克拉玛依834000）

摘要：研究鹰嘴豆水提物的不同组分对a-糖苷酶的抑制作用，其对a-糖苷酶的半抑制浓度为0.20 mg/mL。将鹰嘴豆水提物经过大孔树脂D101筛选，对其不同组分进行活性评价。结果发现鹰嘴豆水提物经过不同乙醇浓度洗脱，其对α-糖苷酶的抑制效果逐渐增强，其中40 %乙醇组分对α-糖苷酶的抑制效果最强。同时应用LC-MS定性分析组分，发现鹰嘴豆水提物中可能存在鹰嘴豆芽素A、大豆皂苷Bb、芒柄花素等物质。说明这些皂苷及异黄酮类化合物影响α-葡萄糖苷酶抑制效果。

关键词：鹰嘴豆；α-葡萄糖苷酶；降糖

鹰嘴豆，学名Cicer aretinum L.，豆科鹰嘴豆属。目前我国鹰嘴豆的主要产地在新疆乌什、木垒等地[1]。中医药认为鹰嘴豆性味甘、平、无毒，有补中益气、温肾壮阳、主消渴、解血毒、润肺止咳等功效，具有很高的保健和药用价值[1]。近年来鹰嘴豆的食药用价值也逐渐被人们所重视。王玉芹[2]等研究发现鹰嘴豆粉具有一定的降血糖作用，其70 %乙醇提取物和水提物降糖作用明显。李燕[3]等研究结果显示鹰嘴豆皂苷和异黄酮对糖尿病小鼠确有降低血糖和调节血脂的功能。综合国内外研究发现鹰嘴豆资源具有降血糖、降血压、降血胆固醇、抗肿瘤、抗氧化、利尿等多种功能，其中活性成分包括大豆异黄酮、皂苷、糖类等。

α-葡萄糖苷酶存在于人体小肠腔内，包括α-淀粉酶、小肠刷状缘的麦芽糖酶、α-糊精酶和蔗糖酶等。人体在正常摄入碳水化合物后经过酶分解成葡萄糖、果糖、半乳糖等，经肠壁细胞吸收而后被人体利用。糖尿病患者因为代谢障碍而导致血糖浓度发生异常变化。预防和治疗这类疾病的一种有效方法就是限制或延缓多糖的分解，所以必须降低α-葡萄糖苷酶活性[4]。而α-葡萄糖苷酶抑制剂能够降低α-葡萄糖苷酶的活性，从而降低多糖的分解速度，有效降低餐后高血糖，如今已作为治疗Ⅱ型糖尿病的有效药物类型。

许多研究认为鹰嘴豆具有降糖功效，然而其降血糖功能成分并不十分清晰。本文将鹰嘴豆水提物通过大孔树脂分离，对不同组分的α-葡萄糖苷酶的抑制效果进行比较，探讨鹰嘴豆中具有的降糖活性成分，为开发利用鹰嘴豆资源提供技术支持。

1　仪器与试剂

鹰嘴豆：购自新疆；鹰嘴豆芽素A、大豆皂苷Bb（分析标准品）：购自阿拉丁公司；α-葡萄糖苷酶（酶活力：30 000 U/g）；对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）：购自Sigma公司；其他试验试剂均为国产分析纯。

全波长酶标仪：美国Thermo Electron公司；TU—1800型紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；旋转蒸发仪：德国Heidolph公司；6460液质联用仪：美国安捷伦科技公司。

2　方法

2.1鹰嘴豆水提物制备

取鹰嘴豆粉100 g加入2 500 mL水中经充分混合后、加热到70℃，浸提2 h，期间每隔10min搅拌1次，过滤离心，取上清液（相当于原材料浓度为

其中：a为含有α-葡萄糖苷酶溶液但不含样品的测定吸光值；b为不含α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的测定吸光值；c为含有α-葡萄糖苷酶溶液及待测样品的测定吸光值；d为不含α-葡萄糖苷酶溶液但含待测样品的测定吸光值。

2.4大孔树脂组分的液相色谱-质谱条件

色谱：色谱柱C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），柱温度保持在30℃，进样量为20 μL。流动相：A（甲醇）和B（0.1 %甲酸水，体积比），使用梯度洗脱如下：0～4.5min，45 %A～70 %A；4.5min～4.6min，70 %A～95 %A；4.6min～10.0min，95 %A；再快速返回初始比例A-B （45：55，体积比），后运行时间6min。液相流量设定为1.0 mL/min。检测波长：260 nm。

质谱：电喷雾ESI，正负离子模式；雾化气：N2；毛细管电压：4 000 V；干燥气体温度：350℃。

2.5统计分析

试验数据用spss软件进行处理，统计学分析应用单因素方差分析（ANOVA）。40.00 mg/mL）稀释成1.00、0.50、0.20、0.10、0.05、0.01 mg/mL备用，以阿卡波糖为对照组。

2.2鹰嘴豆水提物大孔树脂组分分离

鹰嘴豆水液分散于适量的去离子水，反复用D101型大孔吸附树脂（8 cm×100 cm）进行吸附处理，接液流速为8 mL/min。待穿透液（未被吸附）流份于真空泵旋转蒸发仪60℃浓缩并于60℃恒温干燥箱烘干成浸膏，得到58.9 g穿透部位组分（名为Fr.l），接着用不同体积分数的乙醇（0、20 %、40 %、60 %、80 %、100 %）梯度洗脱被吸附的组分，同样方法得到各部位浸膏并分别名为Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6和Fr.7，并冻干成粉末备用。

2.3α-葡萄糖苷酶抑制剂活性测定

α-葡萄糖苷酶抑制剂活性测定参照李明娟等[5]的方法，在600 μL 0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.8）中分别加入200 μL α-葡萄糖苷酶溶（0.2U/mL）和100 μL不同组分的待测样品；将混合物于37℃水浴10min，再加入200 μL 20 mmol/L PNPG溶液，继续反应5min；加入1 mL 1 mol/L Na2CO3作为反应终止液，于405 nm处测其吸光值，计算α-葡萄糖苷酶抑制率。

3　结果与分析

3.1鹰嘴豆水提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

鹰嘴豆水提物经过滤离心后，稀释成不同浓度，检测其α-糖苷酶的抑制活性，以阿卡波糖为对照。如图1所示。

图1　鹰嘴豆水提物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用影响Fig.1 Effect of chickpea water extract on inhibition rate of αglucosidase

从图中可以看出，作用在0～0.1 mg/mL范围内，随浓度增加其对α-葡萄糖苷酶抑制率随之增加。鹰嘴豆水提物浓度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL范围内，其浓度与抑制率呈线性相关，其回归方程为y=0.3175x+0.4127，R2= 0.969 7，求其IC50是0.28mg/mL。在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL范围内，其浓度与抑制率呈线性相关，y = 0.277 8x + 0.444 4，R2= 0.997 6，其IC50为0.20 mg/mL。同时鹰嘴豆水提物与阿卡波糖标准品呈现了几乎平行的抑制曲线。总体上鹰嘴豆水提物具有较好的酶抑制活性。

3.2鹰嘴豆水提物各组分对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

鹰嘴豆水提物大孔树脂不同洗脱组分对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用见表1，从100 g干燥鹰嘴豆粉中提取得到了5 312.50 mg的水提物干粉，总干粉对α-葡萄糖苷酶的抑制率为40.20 %，并且计算得其抑制活力为427.13单位。

表1　大孔树脂洗脱部位对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Table 1 Inhibition rate of constituents to α-glucosidase and of counts

与未洗脱前的样品相比，未吸附的样品组分Fr1抑制率明显下降，说明其活性物质已被大孔树脂吸附。Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7对α-葡萄糖苷酶抑制率分别与鹰嘴豆水提物中经过0 %、20 %、40 %、60 %、80 %、100 %乙醇洗脱后的组分对α-葡萄糖苷酶抑制率对应。经过不同浓度的乙醇洗脱后其抑制率都有所增加，洗脱的组分中，对α-葡萄糖苷酶的抑制率最大的组分为Fr4，其次为Fr3，抑制率最低的为Fr7，说明其活性物质已基本洗脱完全。

同时未被吸附的提取物Fr1的总活力比未洗脱前的样品下降了25.91 %，且大孔树脂吸附的总活力为110.69单位。在洗脱的组分中，总活力单位最大的组分为Fr2，其次为Fr3，总活力最低的为Fr7，随着不同浓度的洗脱，组分质量逐渐下降，总活力也逐渐下降，说明其活性成分被逐渐洗脱。同时大孔树脂吸附鹰嘴豆水提物为929.70 mg，其中未被洗脱存留柱子中质量为195.50 mg，占总量的9.20 %（减少部分可能为色素或杂质）。其中Fr.2-7相加的总活力为79.31单位（18.57%），比吸附的总活力减少了31.38单位（7.3 %）。

图2　Fr1组分在电喷雾负离子模式下的质谱图Fig.2 ESI（-）-MS of compound Fr1

图3　Fr2组分在电喷雾正离子模式下的质谱图Fig.3 ESI（+）-MS of compound Fr2

图4　Fr3组分在电喷雾正离子模式下的质谱图Fig.4 ESI（+）-MS of compound Fr3

3.3应用液相色谱-质谱联用技术对大孔树脂活性组分定性分析

Fr1组分最大吸收波长为262 nm，在保留时间9.585min～9.762min时，ESI-MS m/z：313.2[M+Na+3H]+，855.1 [2M +3H]+，447.4 [M-H]-，491.3 [M +CH2O2-H]-，894.5[2M+2H]-，958.7[M+OH]+981.3[M+Na+OH]+…比对平均相对分子质量以及保留时间，结合文献[6-10]推测Fr1组分中可能存在鹰嘴豆芽素A-7-O-β-D-葡萄糖苷、鹰嘴豆芽素A、大豆皂苷Bb等物质。

图5　Fr4组分在电喷雾负离子模式下的质谱图Fig.5 ESI（-）-MS of compound Fr4

Fr2组分最大吸收波长为256nm，在保留时间9.740min～9.917min时，ESI-MS m/z：267.3 [M+H]+，292.6[M+Na+H]+，534.6[2M+2H]+，428.4[M+H]+，834.2 [2M-Na+H]+，855.2 [2M+H]+…比对平均相对分子质量以及保留时间，结合文献[6-10]推测Fr2组分中可能存在芒柄花素、β-香树脂醇等物质。

Fr3组分最大吸收波长为257nm，在保留时间9.075min～9.164min时，ESI-MS m/z：477.3 [M+3H]+，441.1[M-K+3H]+，883.2[2M+H]+，859.5[2M-Na-2H]+，939.7[M+3H]+，906.3[2M-K+3H]+…比对平均相对分子质量以及保留时间，结合文献[6-11]推测Fr3组分中可能存在大豆精醇A、大豆皂苷Bb等物质。

Fr4组分最大吸收波长为310 nm，在保留时间7.701min～7.790min时，ESI-MS m/z：979.5[M+K-2H]+，980.5[M+K-H]+，981.4[M+K]+…比对平均相对分子质量以及保留时间，结合文献[6-10]推测Fr4组分中可能存在大豆皂苷Bb等物质。

4　讨论

本文采用体外α-葡萄糖苷酶体外抑制模型对鹰嘴豆水提物进行研究，发现鹰嘴豆水提物对α-葡萄糖苷酶有较高的抑制作用，随着浓度的升高其对α-葡萄糖苷酶抑制率也随之增大，当水提物浓度在0.1 mg/mL～1.0 mg/mL范围内其浓度与抑制率呈线性相关，其回归方程为y = 0.317 5x + 0.412 7，R2= 0.969 7，求其IC50是0.28 mg/mL。在0.2 mg/mL～1.0 mg/mL范围内，其浓度与抑制率呈线性相关，y = 0.277 8x + 0.444 4，R2= 0.997 6，其IC50为0.20 mg/mL。其阳性对照阿卡波糖IC50为0.02 mg/mL。说明在低浓度时鹰嘴豆对α-葡萄糖苷酶抑制活性具有剂量依赖性。

本文中鹰嘴豆水提物经过大孔树脂D101筛选获得6个组分。不同组分对α-葡萄糖苷酶均具有较高的抑制活性，而且经过洗脱后其抑制效果均高于鹰嘴豆水提物。但不同组分提取物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果有差异。随着洗脱浓度的增加，其对α-葡萄糖苷酶抑制效果呈现增加的趋势，抑制率最大的组分为Fr4，达到60.6 %，其次为Fr3，抑制率最低的为Fr7，可能是因为在乙醇洗脱过程中有效成分已洗脱，同时α-葡萄糖苷酶抑制活性不仅与浓度有关，还与提取物成分密切相关。在不同洗脱组分中Fr2总活力最多，达4.64 %，其次为Fr3，总活力最低的为Fr7。同时应用LC-MS定性分析鹰嘴豆水提物，发现Fr1组分中可能存在鹰嘴豆芽素A-7-O-β-D-葡萄糖苷、鹰嘴豆芽素A、大豆皂苷Bb等物质；Fr2组分中可能存在芒柄花素、β-香树脂醇等物质；Fr3组分中可能存在大豆精醇A、大豆皂苷Bb等物质；Fr4组分中含有大豆皂苷Bb等物质，由于提取物中杂质较多，没有纯化，确定成分需进一步研究。结果说明鹰嘴豆水提物中含有皂苷及异黄酮类化合物，其对α-葡萄糖苷酶抑制效果明显。同时这些活性成分可能具有协同作用或者存在新结构类群，可以通过拼合原理，增加化合物的成药性，为开发降糖新药奠定基础。

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Study on the Inhibiting Effects of the Aqueous Extract from Chickpeas on the α-Glucosidase

ZHAO Tang-yan1，MENG Qian1，WANG Qin2，ZHANG Qi-bo2，CHEN Xia2，HUANG Yu-jun2，CHEN Da-wei2，GU Rui-xia1，*
（1.Jiangsu Province Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Safety Control，Yangzhou University，Yangzhou 225127，Jiangsu，China；2.Xinjiang Karamay Agriculture Science and Technology Research Institute，Kelamayi 834000，Xinjiang，China）

Abstract：This paper reports the α-glucosidase inhibition of the aqueous extract from different chickpea components is determined.It is found that its half-inhibitory concentration（IC50）to the enzymic activity of α- glycosidase is 0.20 mg/mL.The chickpea aqueous extracts are screened by macroporous resin D101 for evaluation of activity of the different components in it.The results show that through the elution by ethanol of different concentrations，chickpeas aqueous extract shows stronger inhibition effect on α-glycosidase gradually，components with the 40 % ethanol exhibits the strongest inhibitory effect.At the same time, it is determined by LC-MS chromatograms that the different components in the chickpeas aqueous extract may consist of the Biochanin A、Soyasaponin Bb、Formononetin etc，which illustrate that these saponin and isoflavone compounds influence the inhibition effect from α-glycosidase.

Key words：chickpea；α-glucosidase；hypoglycemic

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.002

基金项目：江苏省普通高校研究生科研创新计划项目（KYLX_1348）；江苏省科技支撑项目（BE2011383）；江苏省高校自然科学研究重大项目（12KJA550003）

作者简介：赵堂彦（1990—），男（汉），硕士研究生，研究方向：乳品科学。

*通信作者：顾瑞霞（1963—），男（汉），教授，博士，研究方向：乳品科学。

收稿日期：2015-10-30