酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽工艺的条件优化

刘振锋，戴圣佳，黄小鸣，吕卫金，陈士国，刘东红，叶兴乾，*（.浙江大学馥莉食品研究院，浙江杭州30058；.浙江宇翔生物科技有限公司，浙江杭州3004）



酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽工艺的条件优化

刘振锋1，2，戴圣佳2，黄小鸣2，吕卫金2，陈士国1，刘东红1，叶兴乾1，*
（1.浙江大学馥莉食品研究院，浙江杭州310058；2.浙江宇翔生物科技有限公司，浙江杭州310024）

摘要：研究了鱿鱼皮胶原蛋白肽的酶解加工工艺条件。在单因素试验基础上，通过正交试验的方法对碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶及风味蛋白酶制备鱿鱼皮胶原蛋白肽工艺进行优化。优化的提取工艺条件如下：先用0.3%蛋白酶在pH10.5、温度47.5℃条件下水解4h，再用0.4%木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶按1∶2（质量比）的比例在pH7.5、温度50℃的条件下继续水解4.5h，结果酶解液的水解度可达28.89%、DPPH·清除率为88.24%，多肽转化率为49.74%，同时84.56%的胶原蛋白肽分子量分布介于180 Da～2000 Da之间。在优化的酶解条件下，可以得到较好品质的胶原蛋白肽产品。

关键词：鱿鱼皮；胶原蛋白肽；酶法；正交试验

随着我国水产品加工业的迅猛发展，加工过程中产生大量的废弃物，包括鱼皮、鱼鳞和鱼骨等，约占鱼体总重的50 %～70 %。但是水产品原料利用率低，大量水产品边角料和废弃料被加工成饲料，没有进行精深加工，造成资源的极大浪费，更严重的是导致环境污染[1-2]。同时，水产加工原料利用率低、高附加值产品稀少等成为了水产加工业面临的最为突出的问题，严重限制了水产加工业产业链的延伸和可持续发展[3]。

水产品加工副产物胶原含量很高，且与陆生动物来源的胶原蛋白相比，水产胶原蛋白具有更高的安全性[4]。胶原蛋白肽在消化、吸收、营养等方面具有很多优势，且由于活性中心的暴露而具有很多独特的生理活性，如抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗衰老、预防关节炎、降血压、促进伤口愈合、促进皮肤胶原代谢、免疫调节等多种生理功能[5-9]。当前，胶原蛋白肽已经被广泛的用于食品、生物医药及美容化妆品、饲料添加剂以及其他领域[10-12]。

胶原蛋白肽的研究与开发已成为近年来的热点，如何快速高效的提取纯化胶原蛋白肽成为关键。水产胶原蛋白肽主要通过水解蛋白质法，包括酸法、碱法以及酶法获得。酶法水解比传统的酸法、碱法提取更为温和、安全、专一，不仅降解时间短，产品营养流失较少，而且无环境污染，是目前常用的活性肽制备方法[13-15]。本文主要通过正交设计法优化碱性蛋白酶与木瓜蛋白酶分步提取鱿鱼皮胶原蛋白肽工艺以获得相关参数，并初步分析了获得的胶原蛋白肽分子量范围，以期为深度开发鱿鱼资源、确保加工下脚料和废弃物的综合利用提供试验参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

鱿鱼皮：购于舟山鱿鱼加工厂，清洗沥干后贮藏于-20℃冰箱。

碱性蛋白酶（2.4 AU/g）、风味蛋白酶（500 LAPU/g）：（AU/g：约240 000 U/g～270 000 U/g；LAPU：亮氨酸氨基肽酶单位）诺维信公司；木瓜蛋白酶（200000U/g）：广西南宁庞博生物工程有限公司；Gly-Gly-Tyr-Arg：Sigma公司；二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）、硫酸铜、浓硫酸、硫酸钾、茚三酮、果糖、甘氨酸、三氯乙酸、无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸等均为分析纯。

1.2仪器与设备

HH2型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪：上海嘉鹏科技有限公司；UV-2550紫外可见分光光度计：日本SHIMADZU公司；FD1.0-60型冷冻干燥机：丹麦Heto公司；台式冷冻高速离心机：美国Thermo Scientific公司；Milli-Q超纯水装置：美国MILLIPORE公司；Kjeltec 2300全自动凯氏定氮仪：瑞典FOSS公司；Waters 600高效液相色谱仪：美国Waters公司；DELTA 320 pH计：瑞士METTLER TOLEDO公司；JOYN-8000T喷雾干燥机：上海乔跃实业有限公司。

1.3方法

1.3.1原料预处理

将鱿鱼皮解冻清洗干净，用0.5 % NaOH溶液浸泡12 h，去除鱿鱼皮上的杂蛋白。清水洗净之后，再用0.2 % HAc溶液浸泡12 h，去除鱿鱼皮上的脂肪并溶胶。清水洗净后沥干、切碎，真空包装后贮藏于-80℃冰箱，用于后期试验。

1.3.2酶解过程

取20 g鱿鱼皮置于锥形瓶中，按1∶4（质量比）的比例加水，调节至合适pH，按适当的比例添加蛋白酶，封住瓶口后置于水浴锅中磁力搅拌水解一定时间，取出置沸水中灭酶10min，风味蛋白酶与木瓜蛋白酶是在碱性蛋白酶酶解液基础上进行，正交试验时重复上述步骤，冷却摇匀后离心（4 000r/min，10min），得到胶原蛋白水解液，贮藏于4℃冰箱，并及时测定相关指标。

1.3.3水解度的测定

总氮的测定：凯氏定氮法，参照GB 5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》。

游离氨基氮的测定：参考赵新淮等[16]的方法。取0.100 0 g干燥过的甘氨酸定容至100 mL，取此液分别稀释成2 μg/mL～20 μg/mL的溶液用于标准曲线绘制。取2 mL稀释液加入1.0 mL茚三酮显色剂，摇匀后于沸水浴中加热15min，冷却后加入5 mL 40 %乙醇溶液混匀，静置15min后于570 nm处测定吸光值A，得到的回归方程为y=0.033 82x + 0.112 74，R2=0.992，甘氨酸的分子量为75.07 Da，所以换算成-NH2的物质的量C （μmol）A-C关系为：C=0.393 9A-0.044 4。测定样品中-NH2时，先将水解蛋白液稀释100倍，取0.40 mL稀释液于试管中并加1.60 mL超纯水、1.0 mL显色剂，以后操作同标准曲线。水解度计算公式为：

1.3.4多肽转化率的测定

多肽转化率的测定参考鲁伟等[17]的方法，并稍作修改。先制作标准曲线，用5 % TCA溶液配制不同浓度的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，取4.8 mL标准溶液，加入3.2 mL双缩脲试剂，混匀后静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540 nm处测定吸光值，得到回归方程y=0.359 6x+0.001 2，R2=0.998。测定样品中的多肽含量时，先取2.5 mL样品溶液，加入2.5 mL 10 %的三氯乙酸溶液，混匀后静置10min，4 000r/min下离心15min，将上清液转移到50 mL容量瓶中，并用5 %TCA定容，摇匀，以后操作同标准曲线。

1.3.5DPPH·清除率测定

取蛋白酶解液浓缩，喷雾干燥得鱿鱼皮胶原蛋白肽粉末。配制5 mg/mL胶原蛋白肽溶液，测定其DPPH·清除率。DPPH·清除率的测定参考宁杰等[18]的方法，并稍作修改。取2 mL DPPH溶液与同体积样品液混合摇匀在黑暗处反应30min，于517 nm波长处测定其吸光值。抑制率计算公式如下：

DPPH·清除率/% = [1-（Ai-Aj）/A0]×100

式中：Ai为DPPH·与样品的混合液的吸光度：Aj为乙醇与样品的混合液的吸光度；A0为DPPH·与水的混合液的吸光度。

1.3.6胶原蛋白肽分子量分布测定

参考曾庆冉[19]的方法，通过Waters 600高效液相色谱仪测量胶原蛋白肽分子量分布，色谱柱是TSK gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 nm。吸取2 mL样品于容量瓶中，用流动相乙腈/水/三氟乙酸（45/55/0.1）定容，微孔过滤膜过滤后进样，柱温为30℃，流速为0.5 mL/min，在220 nm下检测。

1.3.7工艺条件优化

以水解度和多肽转化率为评价指标，分别考察水解温度、pH、水解时间、加酶量对碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的影响，并在此基础上，采用L9（34）正交试验对水解工艺条件进行优化。

1.3.7数据处理

采用Origin 8.0制图，采用SPSS 18.0对数据进行方差分析、显著性检验，显著性水平设置为P＜0.05。

2　结果与分析

2.1酶解条件的确定

分别对碱性蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶做酶解条件的优化试验，以水解度和多肽转化率为评价指标，考察水解温度、pH、水解时间、加酶量对蛋白酶水解制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的影响，试验结果见表1。

表1显示酶解温度、pH条件与蛋白酶的最适反应条件相符[20]，反应时间与加酶量也符合生产要求，有利于下一步正交试验的开展。

表1　酶解条件优化的试验结果Table 1 Results of the optimization desigh for eneymes

2.2正交试验优化提取工艺

2.2.1碱性蛋白酶的正交试验

碱性蛋白酶正交试验结果见表2。

表2　碱性蛋白酶正交试验结果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding results of alcalase

利用极差分析结果分析，从表2可以看出，以水解度为指标的因素影响程度依次为：B、D、C、A，即时间＞加酶量＞温度＞pH，最佳组合为：A2B3C2D3；以酶解液抗氧化活性为指标的因素影响程度依次为：A、D、C、B，即pH＞加酶量＞温度＞时间，最佳组合为：A3B2C3D3；以多肽转化率为指标的因素影响程度依次为：D、C、B、A，即加酶量＞温度＞时间＞pH，最佳组合为：A1B1C1D2。

3个指标单独分析出来的最佳组合条件并不一致，根据因素对3个指标的影响程度综合考虑，确定最优工艺条件。pH对酶解液抗氧化活性影响很大，因此pH选择10.5；酶解时间对酶解液水解度的影响较大，因此酶解时间选择4.5 h；酶解温度对多肽转化率的影响是排在第二位的，对其它两个指标的影响均排在第三位，所以酶解温度选择47.5℃；蛋白酶加酶量对多肽转化率的影响是排第一位的，所以加酶量选择0.3%。经过综合分析可知，本试验的较优条件为A3B3C1D2，即碱性蛋白酶加酶量为0.3 %、酶解温度为47.5°C、pH为10.5、酶解时间为4.5 h。在此条件下水解度为14.96 %，DPPH·清除率为83.75 %，多肽转化率为41.05 %。

2.2.2木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶的正交试验

木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶正交试验结果见表3。

表3　木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶正交试验结果Table 3 Orthogonal array design matrix and corresponding results of the mixed papain and flavorzyme

木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶的正交试验过程中，固定加酶总量为0.3 %，按不同比列添加。结果如表3所示，由极差分析结果可以看出，以水解度为指标的因素影响程度依次为：D、B、C、A，即加酶量比＞时间＞温度＞pH，最佳组合为：A2B3C2D3；以酶解液抗氧化活性为指标的因素影响程度依次为：D、C、A、B，即加酶量比＞温度＞pH＞时间，最佳组合为：A2B2C2D3；以多肽转化率为指标的因素影响程度依次为：C、B、D、A，即温度＞时间＞加酶量比＞pH，最佳组合为：A1B1C1D2。

反应体系的pH对抗氧化活性的影响是排第1位的，pH选择7.5；时间对指标的影响有两个第2位，所以考虑B1和B3，取B3时，虽然多肽转化率k3比k1下降了3.16 %，但水解度k3比k1增加了5.56 %，时间选择4h；温度对多肽转化率的影响较大，所以温度选择50℃；加酶量比对水解度和酶解液抗氧化活性的影响均是取D3较好，所以加酶量比选择1∶2（质量比）。经过综合分析可知，本试验的较优条件为A2B3C1D3，该条件下的水解度为19.58 %，DPPH·清除率为87.15 %，多肽转化率为41.79 %。

2.2.3碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶及风味蛋白酶的正交试验

碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶及风味蛋白酶正交试验结果见表4。

表4　碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶及风味蛋白酶正交试验结果Table 4 Orthogonal array design matrix and corresponding results of the three enzymes

碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶及风味蛋白酶的正交试验过程是先用碱性蛋白酶在酶解温度为47.5℃、pH 为10.5的条件下进行酶解，再用1∶2的木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶在pH 7.5、温度50℃的条件下二次酶解，分别考察时间与加酶量的影响。结果如表4所示，由极差分析结果可以看出，以水解度为指标的因素影响程度依次为：C、D、A、B，最佳组合为：A2B2C3D3；以酶解液抗氧化活性为指标的因素影响程度依次为：D、C、B、A，最佳组合为：A1B3C3D3；以多肽转化率为指标的因素影响程度依次为：A、B、C、D，最佳组合为：A1B2C2D2。

从结果可以看出，碱性蛋白酶第一步水解的时间对最终的酶解液多肽转化率影响很大，因此第一步水解时间选择4 h；碱性蛋白酶加酶量对酶解液多肽转化率也是排在第二位的，因此选择0.3 %；木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶的第二步水解时间对水解度的影响是排在第一位的，所以选择4.5 h；木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶的加酶量对酶解液抗氧化活性的影响是排第一位的，所以加酶量选择0.4 %。经过综合分析可知，本试验的较优条件为A1B2C3D3，即先用0.3 %碱性蛋白酶在pH10.5、温度47.5℃条件下水解4 h，再用总量为0.4 %的木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶按1∶2（质量比）在pH 7.5、温度50℃的条件下继续水解4.5 h。通过对工艺进行验证试验可知鱿鱼皮在该条件下酶解，其水解度可达28.89 %、DPPH·清除率为88.24 %，多肽转化率为49.74 %。

2.3胶原蛋白肽分子量分布

在优化后工艺条件下制备获得的胶原蛋白肽分子量分布情况如表5所示。

表5　胶原蛋白肽的分子量分布Table 5 The molecular weight distribution of collagen peptides

由表5可以发现经过碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的两步水解后制备获得的胶原蛋白肽分子量较低，97.63 %胶原蛋白肽分子量小于2 000 Da，84.56 %胶原蛋白肽分子量分布介于180 Da～2 000 Da之间，其中，87.25 %胶原蛋白肽分子量小于1 000 Da。胶原蛋白多肽经蛋白酶等降解处理后制得的产物分子量通常在200 Da～3 000 Da[20]，与本结论相类似。表明碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶3种酶复合酶解有利于小分子肽的形成。十个氨基酸组成的小肽是比较好的产品，分子量小于1 500 Da，而分子量越小，越容易被有效吸收[21]。所以，通过此工艺提取的胶原蛋白肽品质较好，符合市场需求。值得注意的是，产品中分子量小于180 Da的部分比例较高，这可能与风味蛋白酶的酶解机制有关。风味蛋白酶为一种端肽酶，易将蛋白水解成氨基酸，但它对产品风味的改善有很大的帮助。

3　结　论

通过单因素试验，初步考察了酶解温度、酶解时间、pH、加酶量对水解度和多肽转化率的影响，确定了正交试验方案并进行条件优化。通过多次进行正交试验，经极差分析，多重比较，得出酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的最佳提取条件为：即先用0.3 %碱性蛋白酶在pH10.5、温度47.5℃条件下水解4 h，再用总量为0.4 %的木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶按1∶2（质量比）的比例在pH 7.5、温度50℃的条件下继续水解4.5 h。通过对工艺进行验证试验可知鱿鱼皮在该条件下酶解，其水解度可达28.89 %、DPPH·清除率为88.24 %，多肽转化率为49.74 %。通过高效液相分析所得胶原蛋白肽分子量分布，结果显示97.63 %胶原蛋白肽分子量小于2 000 Da，具有较好的品质和较高的利用价值。结论对鱿鱼皮胶原蛋白肽后期进一步的分离纯化及应用具有较高的的理论指导意义。

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Optimization of Enzymatic Preparation of Collagen Peptides from Squid Skin

LIU Zhen-feng1，2，DAI Sheng-jia2，HUANG Xiao-ming2，LÜ Wei-jin2，CHEN Shi-guo1，LIU Dong-hong1，YE Xing-qian1，*
（1.Fuli Institute of Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310058，Zhejiang，China；2.Zhejiang Yuxiang Biotech Co.，Ltd.，Hangzhou 310024，Zhejiang，China）

Abstract：The enzymatic method of collagen peptides from squid skin was studied.One-factor-at-a-time and orthogonal array methods were used to investigate the optimization of enzymatic preparation of collagen peptides from squid skin.The optimum extraction conditions：firstly，alcalase hydrolyzed for 4 h under the conditions of 47.5℃，pH 10.5 and enzyme concentration 0.3 %，then papain combined flavorzyme（1∶2，quality ratio）hydrolyzed for 4.5 h under the conditions of 50℃，pH 7.5 and enzyme concentration 0.4 %，then the peptides maximum DH was 28.89 %，the DPPH·scavenging rate was 88.24 % and recovery ratio of peptides was 49.74 %，in addition，thecontentofthecollagenpeptideshada molecularweightdistributionof180 Da-2000 Da was84.56 %.Result showed that the qualified peptides could be made under the optimized conditions.

Key words：squid skin；collagen peptides；enzymatic；orthogonal array design

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.018

基金项目：杭州市“雏鹰计划”（20131131k132）；富阳市科研攻关专项（2014NK001）；国家自然科学基金（31301417）

作者简介：刘振锋（1980—），男（汉），高级工程师，博士，研究方向：食品科学与工程。

*通信作者：叶兴乾（1962—），男（汉），教授，博士，研究方向：农产品深加工与食品安全。

收稿日期：2014-09-18 2014-12-03