microRNA-103b在急性淋巴细胞白血病患者中的表达及意义

张国君　刘卓刚

110022　沈阳市，中国医科大学附属盛京医院血液内科



·论著·

microRNA-103b在急性淋巴细胞白血病患者中的表达及意义

张国君刘卓刚

110022沈阳市，中国医科大学附属盛京医院血液内科

【摘要】目的微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为21-25nt的内源性单链非编码RNA小分子。本研究旨在探讨miR-103b在急性淋巴细胞白血病(ALL)中的表达及临床意义。方法用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术检测80例初诊ALL患者和20例正常人骨髓单个核细胞标本中miR-103b的相对表达量，并与患者临床资料进行相关性分析。结果miR-103b在ALL患者中的相对表达量高于正常对照组(P<0.05)，但其在急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)及急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)中的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，miR-103b的表达与是否存在bcr-abl融合基因及其mRNA的表达水平无相关性(P>0.05)。结论miR-103b在ALL患者中表达上调，可作为临床诊断ALL的潜在分子标记物，bcr-abl融合基因的表达对miR-103b在ALL中的表达无明显影响。

【关键词】淋巴细胞白血病，急性；bcr-abl；microRNA-103b

急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤性疾病。不同亚型白血病在不同年龄人群中的发病率和预后都不相同，尽管细胞遗传学的技术进步使我们对白血病进行更准确地诊断、风险分层和指导治疗，然而，仍然有约1/4的儿童和更高比例的成人存在周期性复发[1]。因此，需要我们更深入的了解不同亚型白血病间的分子机制，辨识预测治疗失效的风险基因和有助于新型疗法的靶向基因。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长度为19～25个核苷酸的内源性非编码调控RNA。据推测人类基因组可以编码上千种miRNA。miRNA参与细胞生物学功能调节，包括细胞发育和分化、代谢、细胞周期和凋亡等及重要炎症调节[2]。进一步研究发现， miRNA在肿瘤细胞、肿瘤组织和外周血中异常表达，提示在淋巴造血系统肿瘤发生中具有重要作用[3]。有研究发现，miRNA与急性淋巴细胞性白血病的恶性增殖、 诊断、预后和治疗密切相关[4]，针对 miRNA的治疗有望开辟新型的治疗途径。本研究通过检测miRNA-103b在ALL患者中的表达，结合临床资料，探讨miR-103b在ALL发生、发展中的作用及潜在的临床意义。

1资料与方法

1.1一般资料以2014年1月至 2015年 9月我院初诊ALL患者80例(ALL组)为研究对象，所有患者经骨髓细胞学、免疫分型、分子生物学及细胞遗传学检查明确诊断为ALL。80例ALL患者中男44例，女36例；中位年龄34岁。正常为同期来我院就诊的20例骨髓像大致正常患者的骨髓标本，其中男11例，女9例；中位年龄29岁。本研究获得我院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂与仪器人淋巴细胞分离液购自德国Sigma公司，Trizol试剂为美国Invitrogen公司产品，氯仿、无水乙醇、异丙醇购自上海生工生物工程股份有限公司，Mir-XTMmiRNA First Strand Synthesis Kit和Mir-XTMmiRNA qRT-PCR SYBR Kit购自日本Takara Clontech公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTM购自日本Takara公司，bcr-abl(p190)融合基因荧光定量检测试剂盒购自上海通派生物科技有限公司，高速冷冻离心机购自德国Sigma公司，超微量紫外分光光度计购自德国IMPLEN公司，LC480荧光定量PCR仪购自瑞士ROCHE公司。

1.3单个核细胞的分离与总RNA的制备骨髓肝素抗凝，加入淋巴细胞分离液，密度梯度离心，分离单个核细胞。用TRIzol提取单个核细胞总RNA， 超微量紫外分光光度计检测总RNA的浓度和度，已制备的总RNA置于-80℃保存备用。

1.4RNA逆转录和实时定量PCRbcr-abl(p190)融合基因逆转录反应按照逆转录试剂盒说明操作，将mRNA逆转录成cDNA。按照bcr-abl(p190)融合基因荧光定量检测试剂盒说明书配制反应液，并于LC480荧光定量PCR仪进行检测。miRNA逆转录反应体系:2×逆转录缓冲液10 μl，50 nmol/LHas miRNA逆转录引物/U6 snRNA下游引物(1 μmol/L)12 μl，总RNA 2 μl，2 U/μl MMLV逆转录酶0.2 μl，DEPC水20 μl。26℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 10 min。microRNA实时荧光定量反应体系: 2×定量PCRMaster Mix，终浓度1×，用量10 μl; miR-103b上游引物(5’-GAGCAGCATTGTACAG-3’;20 μmol/L)，终浓度0.08 μmol/L，用量0.08 μl;miR-103b下游引物(5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’;20 μmol/L)，终浓度0.08 μmol/L，用量0.08 μl;U6上游引物(5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’;20 μmol/L)，终浓度0.08 μmol/L，用量0.08 μl;U6下游引物(5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’;20 μmol/L)，终浓度0.08 μmol/L，用量0.08 μl;cDNA模板2 μl; Taq DNA聚合酶(2.5 U/μl)，用量0.4 μl; ddH2O终浓度0.05 U/μl加至20 μl。独立重复实验3次， 每次3个复孔。实时定量PCR反应扩增3次，得出Ct均值，应用ΔΔCt相对定量法分析miR-103b表达水平的差异。2-ΔΔCt即为基因表达差异的倍数，采用相对比值来表示相对表达量。

2结果

2.1ALL初诊患者miR-103b的表达水平实时定量PCR检测显示，在ALL组患者miR-103b的相对表达量为(5.52±0.39)，明显高于正常组的(1.22±0.31)，差异有统计学意义(t=-21.13,P<0.05)。见图1。

图1ALL组与正常组骨髓单个核细胞标本中miR-103b的相对表达量对比(*P<0.05)

2.2不同亚型ALL初诊患者miR-103的表达水平B-ALL患者(54例)与T-ALL患者(26例)miR-103b的相对表达量分别为(5.55±0.43)和(5.41±0.42)，均高于正常组，差异均有统计学意义(t=20.21,P<0.05;t=19.70,P<0.05)；而B-ALL与T-ALL患者之间miR-103b的表达水平差异无统计学意义(t=0.58,P=0.58)。见图2。

图2B-ALL患者组、T-ALL患者组与正常人组骨髓单个核细胞标本中miR-103b的相对表达量对比(*P<0.05)

2.3miR-103b与bcr-abl融合基因表达的相关性80例ALL患者中，经荧光定量PCR检测呈bcr-abl(p190)融合基因阳性28例，miR-103b在bcr-abl融合基因阳性ALL患者中的表达水平(5.55±0.46)与bcr-abl融合基因阴性的ALL患者中的表达水平(5.26±0.52)差异无统计学意义(t=1.33,P=0.19)。进一步分析显示，在bcr-abl融合基因阳性的ALL患者28例中，bcr-abl(p190)mRNA的相对表达水平(0.91±0.19)与miR-103b的相对表达水平(5.55±0.46)无显著相关性(r=-0.136,P=0.49)。见图3、4。

图3bcr-abl融合基因阳性和bcr-abl融合基因阴性的ALL患者骨髓单个核细胞标本中miR-103b的相对表达量对比

注：bcr-abl阳性组: bcr-abl融合基因阳性的ALL患者组；bcr-abl阴性组: bcr-abl融合基因阴性的ALL患者组

图428例bcr-abl融合基因阳性的ALL患者骨髓单个核细胞标本中miR-103b与bcr-abl融合基因表达的相关性分析

3讨论

ALL发病时骨髓中异常的原始细胞及幼稚细胞大量增殖并抑制正常造血。对于儿童急性淋巴细胞白血病，无病生存率可达80%[5]，治疗效果较成人急性淋巴细胞白血病好，尽管将儿童急性淋巴细胞白血病治疗经验运用于成人，可以得到较高的缓解率，旦无病生存率仍低于40%，其中bcr-abl融合基因是成人急性淋巴细胞白血病的不良预后的原因之一。在成人B-ALL中，bcr-abl融合基因阳性率达20%～40%,较bcr-abl融合基因阴性的B-ALL有更复杂的基因表达机制，对于治疗也表现出明显的个体化差异[6]。因此，深层次探索新的生物学标志物，为白血病治疗提供新的治疗靶点成为一个研究的重点问题。

miRNA是一个小的非编码的RNA，在肿瘤中可以作为一个癌基因后抑癌基因发挥作用。miR-103b是最近几年才发现的miRNA。Luo等[7]发现血小板来源的miR-103b在参与二型糖尿病中葡萄糖稳态调节发挥重要作用，是诊断二型糖尿病的重要因子。学者发现miR-103b在膀胱癌和结直肠腺癌中有异常的表达，并发挥作用[8，9]。miR-103b还参与脂肪细胞的形成[10]，参与调节胃癌多药耐药过程[11]，参与抑制成骨细胞的生成[12]。但是miR-103b在ALL中的表达情况和作用笔者鲜见报道。

在本研究中，我们检测了ALL患者miR-103b表达水平，结果显示初诊ALL患者miR-103b表达水平明显高于正常对照组(P<0.05)。但在B-ALL和T-ALL的识别方面，miR-103b在B-ALL与T-ALL患者中的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，无法通过miR-103b的表达水平区分B-ALL与T-ALL。另外我们发现miR-103b的表达水平与bcr-abl融合基因的表达水平无相关性(P>0.05)。针对miR-103b如何调控ALL的发生，有待于通过进一步深入研究来发现其调控靶基因的作用机制。

综上所述，本研究展示了在不同分型ALL患者中miR-103b的表达水平，证实miR-103b在ALL患者中较正常人群表达上调，但miR-103b的表达与ALL的免疫分型无关，且bcr-abl融合基因的表达对miR-103b在ALL中的表达无明显影响，这些发现为ALL的诊断和治疗提供了新的思路，具有一定的临床意义。

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Expression and significance of micro RNA-103b in patients with acute lymphoblastic leukemia

ZHANGGuojun,LIUZhuogang.

DepartmentofHematology,ShengjingHospitalofChinaMedicalUniversity,Liaoning，Shenyang110022,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of micro RNA-103b (miR-103b) in patients with acute lymphoblastic leukemia (ALL).MethodsThe relative expression levels of miR-103b were detected by Real time PCR (qRT-PCR) in bone marrow mononuclear cells of 80 patients with ALL (patient group) and 20 healthy subjects (control group) from Shengjing Hospital of China Medical University between January 2014 and September 2014,moreover,the correlations between miR-103b expression and patients’clinical data were analyzed.ResultsThe relative expression levels of miR-103b in patient group were significantly higher than those in control group (P<0.05),however, there were no significant differences in the expression levels of miR-103b between acute B-ALL and acute T-ALL (P>0.05),furthermore, there was no significant correlation between expression levels of miR-103b and bcr-abl positive rates or expression levels of bcr-abl mRNA in ALL (P>0.05).ConclusionThe miR-103b is up-regulated in patients with ALL, which may be served as potential molecule marker in diagnosis of ALL. The expressions of bcr-abl fusion gene have no obvious effects on expressions of miR-103b in patients with ALL.

【Key words】lymphoblastic leukemia,acute; bcr-abl; microRNA-103b

(收稿日期：2015-12-11)

【中图分类号】R 733.711

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)09-1289-03

通讯作者：刘卓刚，110022沈阳市，中国医科大学附属盛京医院血液内科；

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.09.002

项目来源：辽宁省博士科研启动基金项目(编号：20141046)

E-mail：liuzhuogang@gmail.com