葡萄糖酸钙、尼莫地平预处理对大鼠弥漫性轴索损伤后早期ELISA Kit含量变化的影响①

何伟明，李英夫，杨福义

(1.内蒙古自治区通辽市科尔沁区第一人民医院神经外科，内蒙古通辽028000;2.佳木斯大学附属第一医院神经外科，黑龙江佳木斯154003)



葡萄糖酸钙、尼莫地平预处理对大鼠弥漫性轴索损伤后早期ELISA Kit含量变化的影响①

何伟明1，李英夫2，杨福义2

(1.内蒙古自治区通辽市科尔沁区第一人民医院神经外科，内蒙古通辽028000;2.佳木斯大学附属第一医院神经外科，黑龙江佳木斯154003)

摘要:目的:通过对葡萄糖酸钙，尼莫地平预处理的大鼠建立弥漫性轴索损伤(diffuse axonal injury，DAI)模型，并检测其血液中不同时间点的人神经丝蛋白(NF) ELISA Kit的含量，以观察葡萄糖酸钙，尼莫地平预处理对病理演变过程的影响。方法:选健康Wistar大鼠55只，雌雄不限，体重250～300g，随机分成对照组、葡萄糖酸钙组、尼莫地平组。分别给予相关喂养一周，自制mararous A氏致伤装置建立弥漫性轴索损伤动物模型，采用心脏取血的方式分别于6h、24h时采集血液标本。通过酶联免疫法测量血液样本中人神经丝蛋白含量。结果:葡萄糖酸钙预处理组大鼠DAI后血(NF) ELISA Kit含量比对照组明显降低尼莫地平预处理组大鼠DAI后血清(NF) ELISA Kit含量比对照组明显降低。结论:在中、轻型脑外伤患者血脑屏障仍然存在，患者保留了正常调节机制的基础上，维持相对稳定的内环境，维持相对稳定的细胞内外的钙离子浓度差，维持正常跨膜电位，对防止皮质神经元去极化所导致的钙离子大量内流，及由此继发性引起的钙离子依赖性酶促反应群。对降低或减少DAI后的轴索断裂，有着不可低估的实际意义。

关键词:弥漫性轴索损伤;人神经丝蛋白;葡萄糖酸钙;尼莫地平

外伤性脑损伤(traumic brain injury，TBI)可以分为局灶性脑损伤和弥漫性脑损伤两种类型，而弥漫性脑损伤中弥漫性轴索损伤(diffuse axonalinjury，DAI)是在剪应力的作用下所引起的以脑白质轴索断裂、轴索收缩球形成为主要特征的一种弥漫性脑损伤。是导致颅脑伤患者死亡、植物生存和严重神经功能障碍的最主要原因。病死率高［1，2］日益受到临床学者的重视。

1　材料和方法

1.1实验动物和分组

选健康Wistar大鼠55只，雌雄不限，体重250 ～300g，随机分组。(鼠源由佳木斯大学学校动物中心提供)。

分为:对照组，尼莫地平组，葡萄糖酸钙组。其中对照组15只，给予正常饲养。尼莫地平组20只，给予尼莫地平注射液按5%比例混入鼠粮，饮水中喂养。葡萄糖酸钙组20只，给予10%葡萄糖酸钙注射液按5%比例混入鼠粮，饮水中喂养。一周后，麻醉后统一造模，每只间隔时间为5min，并按顺序编号。按时间顺序分别在6h、24h两个时间点麻醉后处死，直接刺人心脏抽吸血液。

1.2动物模型的制作

各组大鼠于手术前12h禁食，自由饮水。参照Marmarou A的方法制作大鼠弥漫性轴索损伤模型。根据打击后不同时间处死。

1.3直接心脏抽吸血液

按致伤时间，用10%水合氯醛300～350mg腹腔注射(0.35mL/100g)麻醉。满意后，将大鼠动物仰卧固定在固定板上，剪去心前区部位的鼠毛，消毒皮肤。在左侧第3～4肋间，用左手食指摸到心搏处，右手取连有4～5号针头的注射器，选择心搏最强处穿刺，迅速而直接插入心脏，避免心脏将从针尖处滑脱;如第一次没刺准，将针头抽出重刺，4℃存放，然后统一3000r/min离心10min充分析出血清。处理后的大鼠处死。

1.4神经纤维细丝蛋白(NF) ELISA Kit测定及计算

以标准物浓度为横坐标(对数坐标)，OD值为纵坐标(普通坐标)，在半对数坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.5统计学方法

采用SPSS19.0软件进行统计学处理，分别将葡萄糖酸钙组，尼莫地平组与对照组进行比较，组间的比较采用配对样本t检验，置信区间为95%。P＜0.05有显著性差异。

2　结果

葡萄糖酸钙、尼莫地平预处理大鼠弥漫性轴索损伤后，6h和24h血中人神经丝蛋白含量的变化，葡萄糖酸钙、尼莫地平组均有显著变化，见表1。

表1　葡萄糖酸钙，尼莫地平预处理对大鼠弥漫性轴索损伤后早期人神经丝蛋白含量变化

3　讨论

DAI作为一个独立的疾病由Adams［5］等于1982年正式命名以来，已被神经外科学界所接受，但目前对其发病机理仍有争论。多数研究者认为当头部受到强大的外力作用后，产生旋转加速度，进而使脑组织内产生一定的剪力，是发生DAI的主要力学机制［3，4］。

在旋转损伤中，产生延迟昏迷的脑损伤往往没有颅内局灶性、扩展性病灶，且不伴有颅内高压，但可以有轻微的脑表面挫伤和小量的蛛网膜下腔及硬膜下腔出血。即由于外伤使脑组织内部易发生剪力作用，即对轴突起横向作用的剪力和(或)对轴突起纵向作用的张力是否超出轴突的承受限度，是导致神经轴索和小血管损伤的关键。根据这一原理制成的动物模型也成功模拟了临床所见的DAI［6］。

DAI具体的发病机制十分复杂。而钙离子一直被认为在DAI神经元的变性及死亡中起到关键性作用。正常细胞外Ca2 +浓度比细胞内高得多。Ca2 +在细胞生命活动中有第二信使之称，参与信息传递、递质及激素的释放、轴突运输、细胞运动等。细胞外钙向细胞内移动有以下四种途径:一是由于电位差使钙离子自外向内移;二是借钙离子受体进入细胞内;三是通过细胞膜浓度差顺向移动;四是细胞内钙离子与细胞外钙离子交换。尽管有四种途径可使细胞外钙向细胞内移动，但是细胞内钙浓度依然很低。真核细胞内Ca2 +浓度小于胞外。其原理与钠钾泵相似。Ca2 +泵水解1个ATP可转运2个Ca2 +，并伴有1个Mg2 +反向转运。以维持细胞内较低的钙离子浓度。血钙主要指血浆钙。在机体多种因素的调节和控制下，血钙浓度比较稳定，正常值2.25～2.75mmol/L。血浆钙中只有离子钙才直接起生理作用。这类反应主要是钙调节蛋白与钙结合使钙内流增加，造成细胞膜的复极化，或激活酶系统，改变代谢水平或代谢方向，产生相应的生理反应［7］，当前研究已发现DAI后钙离子超载的机制主要有:轴膜损伤导致的通透性改变;电压门控钠通道(NaCh)功能障碍;神经兴奋性毒作用及线粒体损伤等.近来研究发现神经元的钙离子超载一方面是由于细胞外钙离子的内流发挥了重要作用，另一方面神经元钙库尤其是内质网(ER)的钙离子释放也可能发挥了重要作用。在多种病理状态下.细胞内钙离子浓度的升高可导致细胞损伤或死亡［9］。

轴索损伤并非受伤当时立即出现，而是渐进性的，损伤越重，轴索损伤出现的速度越快，DAI是一个逐渐演化的轴索内变化过程，轴索肿胀是进行性的，伤后12～24h才发生轴索断裂。进一步的实验证实.随剪应力增大或剪应力作用时间延长。可造成细胞较大的变形，说明机械力大小直接影响细胞反应的严重程度。DAI的剪应力作用与神经元轴膜会导致机械性变形，从而诱导轴膜的膜孔产生，因而轴膜通透性增高.正常状态下不能进入轴膜及正常状态下限制于轴膜内的分子此时可以出入。存这种高通透性下，Ca2 +在细胞内迅速的聚集。因而基于上述研究发现.Kiline等［10］认为机械损伤导致的轴膜损伤是DAI发生机制的关键。

DAI后.神经元胞浆内钙离子浓度升高，使得跨膜电位减弱，从而一方面使得线粒体将ATP用于质膜上的钙泵将钙离子泵入线牲体内从而维持线粒体的跨膜电位，同时使得ATP合成减少。线粒体内高钙离子浓度及线粒体跨膜电位降低诱导开放了线粒体内膜上的线粒体通透性转换孔(mitochondrion permeability transition pore.MPTP)，使得线粒体内膜具有较高的通透性，线粒体的电子链功能异常。H+从线粒体内漏出。这些因素使得活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)的大量产生。通过氧化应激作用加剧了神经元钙离子的聚集。

对于DAI后细胞内钙离子的动态平衡被打破是产生继发神经元损伤或死亡的基础。故此，我们设计了上述实验，以观察葡萄糖酸钙，尼莫地平预处理对病理演变过程的影响。实验结果显示:在DAI 后6h，钙剂预处理组的(NF) ELISA Kit含量明显低于钙离子拮抗剂组及对照组。

我们认为:在中、轻型脑外伤患者血脑屏障仍然存在，患者保留了正常调节机制的基础上，维持相对稳定的内环境，维持相对稳定的细胞内外的钙离子浓度差，维持正常跨膜电位，对防止皮质神经元去极化所导致的钙离子大量内流，及由此继发性引起的钙离子依赖性酶促反应群。对降低或减少DAI后的轴索断裂，有着不可低估的实际意义。

参考文献:

［1］Bennett M，O'Brien DP，Phillips JP.Clinicopathologic observations in 100 consecutive patients with fatal head injury admitted to a neuro surgicalunit［J］.Ir Med J，1995，88(1) : 60－62

［2］孟尧，过宗南，刘建民，等.脑弥漫性轴索损伤［J］.中华神经外杂志，1991，7(2) : 93－95

［3］Gennarelli TA，Thibault LE，Adams JH，et al.Diffuse axonal injury and traumatic coma in the primate［J］.Ann Neurol，1982，12: 564 －574

［4］Adams JH，GrahamDI，MurrayLS，et al.Diffuse axonal injury due to non－missile head injury in human: analysis of 45 cases［J］.Ann Neurol，1982，12: 557－564

［5］Adams JH，Duchen LW.Greenfield s Neuropathol; ogy［J］.Fifth E-dition，1992: 122－134

［6］宋锦宁，刘守勋，戈治理，等.脑弥漫性轴索损伤的特点及临床诊断［J］.中国神经精神疾病杂志，1997，23(3) : 141－144

［7］Fuller KE，Casparian JM.Vitamin D: balancing cutaneousand systemic considerations［J］.South Med J，2001，94(1) : 58－64

［8］Skandsan T，Kvistad KA，Solheim O，et al.Prevalence and impact of diffuse axonal injury in patients with moderate and severe head injury: acohort study of early magnetic resonance imaging findings and lyear outcome［J］.J Neurosurg，2010，113(3) : 556－563

［9］Kiline D，Gallo G，Barbee KA.Mechanically－induced membrane potation caascs axonal beading and localized eytoskeletal damage［J］.Exp Nenrol，2008，212(2) : 422－430

(收稿日期:2015－11－18)

通讯作者:李英夫(1979～)男，黑龙江明水人，硕士，主治医师。E－mail: 99656218qq.com。

作者简介:①何伟明(1974～)男，内蒙古通辽人，在读博士研究生，主治医师。

中图分类号:R651.1+5

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0073－02