口腔鳞癌组织中TLR4及NF－κB p65的表达和意义①

杨　键，张国梁，关　键

(1.佳木斯大学研究生学院，黑龙江佳木斯154007;2.佳木斯大学附属第二医院，黑龙江佳木斯154002)



口腔鳞癌组织中TLR4及NF－κB p65的表达和意义①

杨键1，张国梁2，关键2

(1.佳木斯大学研究生学院，黑龙江佳木斯154007;2.佳木斯大学附属第二医院，黑龙江佳木斯154002)

摘要:目的:讨论在口腔鳞癌(Oral squamous cell carcinomas，OSCC)发生发展过程中Toll样受体4 (toll like receptor 4，TLR4)、核因子－κB p65(NF－κB p65)存在的作用。方法:采用免疫组化SABC法分别检测TLR4、NF－κB p65在11例癌旁正常组织和37例OSCC组织中的表达情况，讨论两者表达的相关性以及与OSCC中不同临床病理因素之间的关系。结果: TLR4、NF－κB p65的阳性率在OSCC组织中较癌旁正常组织高(P均＜0.05) ; TLR4、NF－κB p65的阳性率与OSCC组织的局部侵袭性、分化程度相关(P均＜0.05)，NF－κB p65的阳性率还与淋巴结转移相关(P = 0.023) ; TLR4、NF－κB p65在OSCC组织中的阳性率呈正相关(r = 0.618，P = 0.000)。结论: TLR4、NF－κB p65对OSCC的发生发展有重要意义。

关键词:口腔鳞癌;核因子－κB p65; Toll样受体4;免疫组化

口腔鳞癌(Oral squamous cell carcinomas，OSCC)多发于鳞状上皮覆盖的部位，它的发病机制至今还未完全阐明。90%左右的口腔颌面部恶性肿瘤为OSCC，并且近年来呈现逐渐上升且年轻化的趋势［1］。它的致病因素复杂，不仅与外在因素如烟酒、物理、化学刺激相关，也与内在因素如精神、免疫、遗传相关。近年来随着相关学科的进步，对OSCC的研究也不断深入，通过研究相关基因、受体等肿瘤标志物在OSCC组织中的表达情况以便对其发生和发展的过程作进一步深入了解已经成为研究的热点问题［2］。本实验通过SABC法分别检测Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)、核因子－κB p65 (NF－κB p65)在OSCC、癌旁正常组织中的表达情况，剖析阐述两者在OSCC、癌旁正常组织中不同表达特征间的联系以及与OSCC临床病理因素之间存在的关系，旨在讨论OSCC发生和发展过程中TLR4、NF－κB p65可能存在的作用。

1　材料和方法

1.1材料

采集佳木斯大学附属口腔医院2013～2015年初经本院口腔颌面外科手术治疗并经病理诊断为OSCC的成年患者共计37例，上述患者临床病理学资料详实，术前3个月内均未接受放化疗，其中男30例，女7例;年龄41～88岁，平均63.8岁;淋巴结转移9例，未见淋巴结转移28例;有局部侵袭性33例，无局部侵袭性4例;按照2005年WHO制定的标准分为高分化10例、中分化23例、低分化4例。另取11例癌旁正常组织，并经HE染色，镜下观察证明无任何黏膜疾病。以上标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋后按每张4μm的厚度作连续切片。

1.2试剂

一抗兔抗人TLR4(1: 150)、NF－κB p65(1: 150)亲和纯化抗体，SABC检测试剂盒，DAB试剂盒均购于武汉博士德生物有限公司。

1.3方法与判定标准

采用免疫组化SABC法，严格按照说明书要求操作。出现黄或黄褐色为阳性着色，TLR4的表达产物位于细胞质、细胞膜中，NF－κB p65的表达产物位于细胞质、细胞核中。实验结果根据切片的着色强度以及阳性OSCC细胞数在OSCC细胞总数中的占比这两方面进行综合分析判断，判定OSCC细胞的着色强度:无着色(－)，淡黄色(+ )，黄色(+ + )，黄褐色(+ + + ) ;判定阳性OSCC细胞占比:随机在切片中选择5个400倍的高倍细胞视野，阳性细胞占比≤10% (－)，11%～25% (+ )，26%～49%(+ + )，≥50% (+ + + ) ; (－)、(+ )、(+ + )、(+ + + )分别代表0分、1分、2分、3分。每张切片按着色强度与阳性OSCC细胞在OSCC细胞中的占比相加得出。阴性(＜2分)，阳性(≥2分)。每批次实验均设置空白对照(PBS代替一抗)、阳性对照(已知阳性切片)。

1.4统计学方法

采用SPSS21.0软件，采用Fisher确切概率法进行组间数据比较;使用Spearman秩相关检验分析指标间的关系;使用Kruskal－Wallis H检验分析病理等级资料。均以α=0.05为检验标准。

2　结果

2.1 TLR4、NF－κB p65在OSCC、癌旁正常组织中的表达

在OSCC组织中TLR4、NF－κB p65的阳性率分别为56.8%、54.1%，在癌旁正常组织中的阳性率分别为18.2%、9.0%，组间差异有统计学意义(P均＜0.05，见表1) ; TLR4、NF－κB p65在OSCC组织中的阳性表达(见图1～2)。

免疫组化SABC法检测OSCC组织中TLR4、NF－κB p65的表达(箭头所指处为肿瘤细胞)。

图1　TLR4(×400)

图2　NF－κB p65(×400)

2.2 TLR4、NF－κB p65在OSCC组织中的表达与

病理因素之间的关联

TLR4、NF－κB p65在OSCC组织中的阳性率与性别、年龄无关(P均＞0.05)，与分化程度、局部侵袭性有关(P均＜0.05) ; NF－κB p65的阳性率还与淋巴结转移有关(P＜0.05)。见表1。

表1　TLR4和NF－κB p65在癌旁正常组织中的表达及在OSCC组织中的表达与临床病理因素之间的关系

2.3 TLR4、NF－κB p65在OSCC组织中表达关系

在21例TLR4呈阳性表达的OSCC组织中，有20例NF－κB p65也呈阳性表达，两者在OSCC组织中的表达呈正相关(r = 0.618，P＜0.01)，见表2。

表2　TLR4、NF－κB p65在OSCC组织中的表达关系

3　讨论

口腔鳞癌是多种复杂因素共同作用导致的疾病，要改善患者的预后，关键就需要做到尽早诊断尽早治疗。近年来发现肿瘤的产生和发展与TLR4、NF－κB p65的过度活化密切相关［3，4］。研究表明，TLRs通过激活NF－kB所构建的肿瘤微环境在促进恶性肿瘤的发生和发展中有重要的作用。目前TLRs和NF－kB作为多种疾病的治疗靶点已经成为研究的热点。

TLRs属于I型跨膜蛋白，为单个的跨膜非催化性蛋白质，分为胞外结构域(识别受体，介导形成胞外受体复合物)，跨膜结构域以及胞内信号区(激活下游信号传导区域)，根据TLRs识别病原相关分子模式的不同可将其分为不同种类，目前为止发现的TLRs至少已经有11种。其中TLR4是最早被发现的一种广泛存在于多种正常细胞和肿瘤细胞中参与天然免疫的病原相关分子模式识别受体，在天然免疫和获得性免疫间起到桥梁作用，肿瘤细胞逃脱免疫监视及生长转移与它的异常高表达密切相关。本研究表明TLR4在OSCC组中的阳性表达率(56.8%)较癌旁正常组(18.2%)高(P＜0.05) ;同时对不同分化程度的OSCC中TLR4的阳性率(分别为高分化20%、中分化69.6%、低分化75%)，进行H检验分析，表明随着OSCC分化程度降低，TLR4的阳性率逐渐增高(P＜0.05) ;此外TLR4的过表达与OSCC是否存在局部侵袭性密切相关(P＜0.05)。而且TLR4在OSCC组织中的表达与年龄、性别(P均＞0.05)无关，这些都提示TLR4的异常高表达可能通过相应的信号传递从而诱发级联反应，在OSCC的发生、发展、侵袭过程中起重要作用，这符合王［5］在子宫内膜癌中关于TLR4 和NF－κB p65的研究。

NF－κB是一种可以通过对靶基因的调节从而参与细胞增殖、分化、凋亡等活动的核转录因子。NF－κB家族包含五个多肽链亚基，在静息状态下它们互相之间以二聚体的形式结合，无活性的存在于细胞质中，根据组成二聚体的蛋白不同分为同源或异源两种，其中主要是p65/p50异二聚体(p65是发挥转录激活功能的主要成分［6］)。当NF－κB通路受炎症、细胞因子等刺激被激活后，使细胞质中与NF－κB结合的抑制因子IkB泛素化降解，并最终活化NF－κB从细胞质转位进入细胞核，参与多种细胞的应激、增殖、凋亡、合成和分泌细胞因子等生理病理过程［7］。研究发现多种恶性肿瘤中都存在NF－κB的过度活化。本研究表明NF－κB p65在OSCC组中的阳性率(54.1%)较癌旁正常组(9.0%)高(P＜0.05)，同时对不同分化程度的OSCC中NF－κB p65的表达情况进行统计学分析后，发现其行为与TLR4类似，也是随着OSCC组织的分化程度降低，NF－κB p65的阳性率增高(P＜0.05)，这符合有关学者［8］在胃癌中关于NF －κB p65的研究。此外NF－κB p65的阳性率在具有局部侵袭性的OSCC组织中异常增高(P＜0.05)，提示NF－κB p65的过表达在OSCC发生、发展、侵袭中可能发挥重要作用，亦提示NF－κB p65过度活化后在细胞恶变，癌细胞增殖、抗调亡过程可能起到促进作用。

同时，对TLR4、NF－κB p65在OSCC组织中的表达水平进行统计分析后，发现两者呈正相关关系(r = 0.618，P＜0.01)，TLR4可能对NF－κBp65的生成起到正向调节作用，两者在OSCC组织中的表达变化具有比较显著的协同性。提示TLR4 /NF －κBp65通路的过表达对OSCC的发生发展可能起到促进作用，其可能原因是该通路参与影响了细胞间黏附蛋白、细胞内周期蛋白等关键蛋白的的合成，并且调控了抗凋亡基因的表达，从而使OSCC侵袭性变强，分化程度变差并且出现淋巴结的转移。可以设想，对通路关键环节进行控制可能是用于治疗OSCC的新思路。此外本次研究还发现在OSCC组织中NF－κB p65的阳性率与淋巴结转移有关(P＜0.05)，提示NF－κB p65的过度活化可能参与了OSCC的淋巴结转移过程，但是与NF－κB p65不同的是，TLR4在OSCC组织中的阳性率与淋巴结转移因素无明显相关性(P = 0.05)，这个结果可能与本次实验收集的OSCC例数太少有关，也可能提示TLR4/NF－κB p65信号通路可能受多种因素调控影响。

综上所述，通过联合检测分析TLR4、NF－κB p65在OSCC中的表达情况对于临床上OSCC的诊断、恶性程度的评估有现实意义。下一步研究准备通过分别抑制OSCC细胞中TLR4、NF－κB p65的表达，检测分析两者对OSCC细胞增殖、凋亡等影响，以期为OSCC的预防和靶向治疗提供新线索。

参考文献:

［1］Kornfeld J W，Meder S，Wohlberg M，et al.Overexpression of TACE and TIMP3 mRNA in head and neck cancer: association with tumour development and progression［J］.British Journal of Cancer，2010，104(1) : 138－145

［2］Pratheepa L，Ramani P，Sherlin H J，et al.Expression of emerging novel tumor markers in oral squamous cell carcinoma and their clinical and pathological correlation to determine the prognosis and usefulness as a therapeutic target: a systematic review［J］.Journal of Natural Sciences Research，2012，2(1) : 57－66

［3］Rich A M.Toll－Like Receptors and Cancer，Particularly Oral Squamous Cell Carcinoma［J］.Frontiers in Immunology，2014，5: 464

［4］DiDonato J A，Mercurio F，Karin M.NF‐κB and the link between inflammation and cancer［J］.Immunological reviews，2012，246 (1) : 379－400

［5］王花.TLR4和NF－κB p65在子宫内膜样癌中的表达及临床意义［J］.中国妇幼保健，2014，26: 4240－4242

［6］Wullaert A，Bonnet M C，Pasparakis M.NF－κB in the regulation of epithelial homeostasis and inflammation［J］.Cell research，2011，21(1) : 146－158

［7］Witzel I I，Koh L F，Perkins ND.Regulation of cyclin D1 gene expression.［J］.Biochemical Society Transactions，2010，38: 217－222

［8］陈军，覃思繁，林思彤，等.胃癌组织中c—FLIP、NF—kBp65的表达变化及意义［J］.山东医药，2013，(3) : 22－24

(收稿日期:2015－07－30)

通讯作者:关键(1969～)男，黑龙江齐齐哈尔人，硕士，教授，主任医师，硕士研究生导师。E－mail: guanjian1207@163.com。

作者简介:杨键(1990～)男，浙江临安人，在读硕士研究生。

基金项目:①佳木斯大学研究生科技创新项目，编号: LM2014－040。

中图分类号:R739.81

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0047－03