HtrA1丝氨酸蛋白酶在子宫内膜异位症中的表达①

张立娜，吕敬媛，宋宝杰，邢天容，陈　丽

(佳木斯大学附属第一医院妇产科，黑龙江佳木斯154003)



HtrA1丝氨酸蛋白酶在子宫内膜异位症中的表达①

张立娜，吕敬媛，宋宝杰，邢天容，陈丽

(佳木斯大学附属第一医院妇产科，黑龙江佳木斯154003)

摘要:目的:观察丝氨酸蛋白酶HtrA1在子宫内膜异位症(Endometriosis，EMT)中在位内膜和异位内膜以及正常子宫内膜和血清中的表达情况，探讨HtrA1在子宫内膜异位中的作用以及临床意义。方法:通过S－P免疫组织化学方法检测HtrA1在50例EMT患者在位内膜和异位内膜组织的表达，并与50例正常内膜进行比较;应用ELISA法检测以上所有患者血清中HtrA1的浓度。结果: HtrA1在EMT患者异位及在位内膜的表达显著低于对照组(P＜0.05) ;在异位内膜的表达显著低于在位的内膜组(P＜0.05) ;在EMT患者外周血清中浓度显著低于对照组(P＜0.05) ;术前外周血中HtrA1的水平均显著低于术后第7天(P＜0.05)。结论: HtrA1可能在EMT的发病过程中起到一定作用，并且HtrA1可以作为EMT临床诊断及预后随访的血清标记物。

关键词:丝氨酸蛋白酶A1;免疫组织化学;酶联免疫吸附实验;子宫内膜异位症

子宫内膜异位症(endometriosis，EMT)是指包括腺体和间质在内的正常活性的子宫内膜组织，通过各种方式转移到子宫腔或子宫体肌层之外的其它部位［1］。既往研究表明，异位子宫内膜组织的存活、增殖与肿瘤组织的浸润、增殖、远处转移等恶性行为相似［2］。HtrA1(high－temperature requirement factor A1)是具有肿瘤抑制效应的丝氨酸蛋白酶家族成员之一，具有肿瘤抑制效应，在原发性肝癌及宫颈癌、卵巢癌中均呈低度表达［3～5］，并且在子宫内膜癌中也得到证实。本实验通过研究EMT患者HtrA1分别在组织和血清中的表达，探讨此因子在EMT进展过程中的意义，对进一步阐明EMT病理生理机制大有裨益。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2014－09～2015－06在佳木斯大学第一附属医院妇科收治的术后的病理回报为子宫内膜异位囊肿的病患50例作为实验组，取异位和在位内膜组织，分为异位内膜组和在位内膜组。另选同时期因子宫疾病(排除子宫内膜异位症)，行手术治疗的患者50例作为对照组，取其正常子宫的内膜为对照组。入选患者年龄34～47岁，平均(38.2±9.1)岁，平均初潮年龄(14.7±2.5)岁，所有患者月经规律者，采集标本之日前6个月内，未接受过任何激素治疗者，近6个月内未有妊娠、哺乳等，近6个月内未接受过放疗、化疗、生物治疗者，近1年内未使用过宫内节育器者，病理专家复核确诊病理切片。

1.2标本处理

①内膜组织:将处理干净的病理组织置40g/L甲醛液中固定24h，制成蜡块，4℃保留;②血清:分别抽取所有研究对象手术当天及术后第7天晨起空腹时外周静脉血2mL至促凝管内，置水浴箱静止

采用SPSS17.0软件进行统计学分析，对计数资料用χ2检验，对计量资料用t检验，所得数据均已均数±标准差(±s)的形式表示，P＜0.05有显著差异。

2　结果

2.1 HtrA1在内膜组织中的表达

经统计学分析显示EMT组HtrA1在异位及在位内膜的阳性表达率显著低于对照组(P＜0.05) ;且在位的内膜组的阳性表达率显著高于异位的内膜组(P＜0.05)。见表1，图1。 10min，水浴箱的温度为37℃，然后离心8min(速度: 4000r/min)，取上清液体置于干燥的无菌管内，置－80℃环境中冷藏保存备测。

1.3实验方法

采用SP法检测HtrA1在各种内膜组织中表达;外周血清中HtrA1浓度采用ELISA法进行检测。HtrA1抗体及血清试剂盒均来自于哈尔滨市南岗区赛特生物技术工作室。按试剂的说明进行各项实验操作。

1.4结果判定

每个标本做切片3张，每张切片在×400倍镜下取4个互不重叠的视野，计数100个细胞，共400个细胞，并数出染色细胞的数量，计算该切片(即该标本)的染色细胞所占比例=染色细胞总数/400× 100%。HtrA1染色结果判定: HtrA1主要在细胞核内表达，为棕黄色或黄褐色颗粒。阴性－) :染色细胞比例≤5%;弱阳性(+ ) :染色细胞比例在6%～25%;中等阳性() :染色细胞比例在26%～50%;强阳性() :染色细胞比例＞50%。

1.5统计学方法

图1 A正常子宫内膜B在位内膜C异位内膜(免疫组化染色，×400)

表1　HtrA1在异位内膜、在位内膜、对照组的表达(n =50)

2.2血清中HtrA1的表达

HtrA1在EMT组术前血清中浓度显著低于对照组(P＜0.05)。术前外周血中HtrA1的水平均显著低于术后第7天(P＜0.05)。见表2。

表2　血清中HtrA1的表达(±s，n =50，pg/mL)

表2　血清中HtrA1的表达(±s，n =50，pg/mL)

注:*与对照组相比，P＜0.05;#与术后7d相比，P＜0.05。

组别　　术前　　术后7d EMT组　121.92±56.78* #　196.78±74.26*对照组392.59±56.17　390.47±83.41

3　讨论

HtrA家族广泛存在于微生物及动植物组织中，目前发现在多种病理生理过程中均有该家族成员参与，如细胞凋亡、生长、衰老及应激反应、癌症、关节炎等［4］。HtrA1是近年来新发现的丝氨酸蛋白酶家族成员之一，该因子在原发性肝癌、卵巢癌、宫颈癌及子宫内膜癌中均呈低度表达，并随肿瘤恶性程度的升高，其下调性表达越明显，表明HtrA1具有肿瘤抑制效应［3～6］。EMT虽为良性病变，但是生物学行为却具有恶性肿瘤的特征(侵袭性、远处转移等)，本研究结果显示HtrA1在EMT患者异位的内膜表达低于对照组，表明HtrA1可能参与盆腔内其他部位EMT的进展过程。

本实验结果显示，HtrA1在EMT患者在位的内膜中表达明显低于对照组别，经统计学分析差异有意义，提示从生物学行为的角度，在位的内膜与正常子宫的内膜具有差别，在位的内膜的生物学行为可能是EMT发生过程中一个比较重要的因素，从而验证了“在位内膜决定论”。卵泡抑素(follistatin FS) 和HtrA1的N末端区域具有高度相似性，FS是TGF －β的拮抗剂，因此提出HtrA1是一种新型的TGF －β拮抗剂［7］。诸多研究提示TGF－β在EMT异位病灶中表达显著升高，HtrA1可拮抗TGF－β信号通路的活化，抑制细胞增殖，表现为肿瘤抑制效应。本实验结果表明HtrA1在异位、在位内膜及对照组中的表达呈上升趋势，异位病灶的形成涉及了细胞增殖过程，因此表现为增殖抑制效应的HtrA1的表达受到抑制甚至无表达，削弱对TGF－β及TGF－β介导的信号通路效应，导致TGF－β内腹腔内异位病灶处高表达，促进异位的内膜的增殖以及存活，EMT进展过程起到重要的作用。

本实验还检测了所有患者血清中HtrA1的浓度，结果示EMT组低于对照组，EMT组术前血清中HtrA1的浓度低于术后第7天，表明其可能具备血清标志物的特性，可能具有一定的临床价值，或许可为EMT的术前诊断及预后随访提供新思路。但本次实验研究样本量较少，实验数据存在一定误差和局限性，需待更多严谨的设计，大量的样本，多中心进行的临床研究进一步明确其相关临床意义。

综上所述，HtrA1在EMT患者异位和在位的内膜及血清中表达低于对照组，但是术后第七天EMT患者薛强中的表达高于术前，表明从组织学及血清学角度进行分析，HtrA1可以作为EMT诊断及预后随访的血清标记物，同时HtrA1可能在EMT进展过程中起到一定的作用。

致谢:感谢佳木斯大学科技创新项目对我的资助，感谢佳木斯大学实验中心的老师们对我的帮助。

参考文献:

［1］胡玉红，石瑾，张燕.子宫内膜异位症患者survivin蛋白的表达及临床意义［J］.黑龙江医药科学，2010，33(2) : 39－40

［2］刘德财，卢北燕，罗佳滨.子宫内膜异位症的免疫病因学研究进展［A］.黑龙江医药科学，2009，32(4) : 87－89

［3］金雷，朱峰，秦锡虎.HtrA1丝氨酸蛋白酶在原发性肝癌中的表达及其临床意义［J］.中国普通外科杂志，2011，20(1) : 43－47

［4］Park S－S，Park S－K，Lim J－H，et al.Expression of human HtrA1，HtrA2，HtrA1 and TGF－β1 genes in primary endometrial cancer［J］.Oncol Rep，2009，21(1) : 1529－1537

［5］Singh H，Li Y，Fuller PJ，et al.HtrA1 is downregulated in cancer cell lines and significantly reduced in primary serous and granulosa cell ovarian tumors［J］.J Cancer，2013，4(2) : 152－164

［6］Bowden M a，Drummond AE，Fuller PJ，et al.High－temperature requirement factor A3 (HtrA1) : A novel serine protease and its potential role in ovarian function and ovarian cancers［J］.Mol Cell Endocrinol，2010，327(1－2) : 13－18

［7］Park S－S，Park S－K，Lim J－H，et al.Expression of human HtrA1，HtrA2，HtrA3 and TGF－β1 genes in primary endometrial cancer［J］.Oncol Rep，2009，21(1) : 1529－1537

(收稿日期:2015－12－03)

通讯作者:吕敬媛(1978～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，副主任医师，硕士研究生导师。E－mail: 503253411@ qq.com。

作者简介:张立娜(1986～)女，黑龙江黑河人，在读硕士研究生。

基金项目:①佳木斯大学研究生科技创新项目，编号: LZR2014_015。

中图分类号:R711.71

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－0042－02