姜黄素对肾脏缺血再灌注损伤大鼠模型保护作用的研究

徐卫强，郭园园，关　超，方文革，查泽玉



·基础医学·

姜黄素对肾脏缺血再灌注损伤大鼠模型保护作用的研究

徐卫强1，郭园园2，关超1，方文革1，查泽玉1

［摘要］目的:探讨姜黄素对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法:将60只SD大鼠随机分为假手术组(A组)、缺血再灌注组(B组)、姜黄素+缺血再灌注组(C组)和姜黄素+缺血再灌注组+锌－原卟啉组(D组)，各15只。C组和D组术前5 d腹腔注射姜黄素100 mg/kg，A、B组注射等量的0．9%氯化钠注射液。D组大鼠术前60 min腹腔注射锌－原卟啉20 μmol/kg。手术游离并阻断双肾肾蒂血管，60 min后恢复灌注，分别于4 h、12 h、24 h取血检测血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血红素氧合酶-1(HO-1)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)的表达，24 h切除肾组织检测肾组织髓过氧化物酶(MPO)活性的表达水平。结果:C组和D组血清SCr、BUN、TNF-α、ICAM-1及肾组织MPO水平均高于A组，但低于B组(P＜0．05～P＜0．01) ; HO-1的表达低于A组，高于B组(P＜0．05～P＜0．01)。D组TNF-α和ICAM-1表达水平在各时间点均高于C组(P＜0．05～P＜0．01)，SCr、BUN及肾组织MPO的表达在12 h和24 h高于C组(P＜0．05～P＜0．01)，在4 h时差异无统计学意义(P＞0．05) ; HO-1在各时间点表达均低于后者(P＜0．05～P＜0．01)。结论:姜黄素对肾脏缺血再灌注损伤具有保护作用，能够有效减轻肾组织的炎性及氧化应激损害。HO-1可能参与姜黄素对肾脏的保护。

［关键词］姜黄素;缺血再灌注;血红素氧合酶-1;大鼠

［作者单位］1．蚌埠医学院第二附属医院泌尿外科，安徽蚌埠233040; 2．上海交通大学医学院附属第三人民医院烧伤整形科，上海201999

肾缺血再灌注损伤是指肾组织缺血时和其后恢复血液灌注时器官功能不能恢复正常，甚至发生更为严重的组织损伤或器官功能衰竭。近年来，姜黄素因其良好的抗氧化和抗炎症反应等作用，广泛应用于保护心、脑、肺等器官的缺血再灌注损伤［1］，且在肾缺血再灌注保护方面同样显示出良好的应用前景，已受到国内外学者的广泛关注，成为研究的热点。然而，其保护机制尚未完全明确，对肾缺血再灌注损伤的保护机制更是少有研究，且研究仍不够深入。本研究旨在探讨姜黄素能否对肾脏缺血再灌注损伤起到保护作用及其作用机制，为临床应用姜黄素防治肾脏手术造成的损伤提供理论依据。

1　材料与方法

1．1实验材料

1．1．1实验动物雄性SD大鼠60只，6～8周龄，质量200～250 g，蚌埠医学院实验动物中心提供。

1．1．2试剂姜黄素、锌-原卟啉购于美国Sigma公司，血红素氧合酶-1 (HO-1)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、髓过氧化物酶(MPO)、细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)等检测试剂盒购自美国R＆D公司。

1．2实验方法

1．2．1动物模型制备将大鼠随机分为假手术组(A组)、缺血再灌注组(B组)、姜黄素+缺血再灌注组(C组)和姜黄素+缺血再灌注+锌－原卟啉组(D组)，各15只。术前常规喂养，C、D组大鼠术前5 d腹腔注射姜黄素100 mg/kg，A、B组注射等量的0．9%氯化钠注射液。D组大鼠术前60 min腹腔注射锌－原卟啉20 μmol/kg，其余3组注射等量0．9%氯化钠注射液。术前禁食12 h，不禁水。手术给予腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg(即300 mg/ kg)麻醉，取腹正中切口，游离双肾肾蒂血管，血管夹夹闭肾动静脉，60 min后恢复灌注。A组大鼠仅游离肾血管，但不夹闭。分别于再灌注后4 h、12 h、24 h经腹主动脉取血，分离血清待测。

1．2．2肾功能检测蚌埠医学院第二附属医院检验科应用多功能生化分析仪检测肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)。

1．2．3血清TNF-α、ICAM-1、HO-1及肾组织MPO水平检测采用酶联免疫吸附试验法严格按照各检测试剂盒说明书操作。

1．3统计学方法采用方差分析和q检验。

2　结果

2．1 4组大鼠不同时间血清SCr和BUN测定B、C和D组大鼠各时间点血清SCr、BUN水平均明显高于A组(P＜0．01)，与B组比较，C组和D组SCr、BUN水平均明显降低(P＜0．01)。D组SCr、BUN水平在再灌注12 h和24 h时均高于C组(P＜0．05～P＜0．01)，而再灌注4 h差异无统计学意义(P＞0．05) (见表1)。

2．2 4组大鼠血清TNF-α、HO-1、ICAM-1及肾组织MPO水平比较A组大鼠各时间点4项血清学指标均明显低于其余3组(P＜0．01)。与B组比较，C、D组大鼠各时间点血清TNF-α、ICAM-1及肾组织MPO表达均降低(P＜0．05～P＜0．01)，而HO-1水平均增高(P＜0．05～P＜0．01)。与C组比较，D组在各时间点TNF-α和ICAM-1水平均增高，而MPO的表达在12 h和24 h增高明显，HO-1在各时间点均降低(P＜0．05～P＜0．01) (见表2、3)。

表1　各组大鼠缺血再灌注各时间点血清SCr和BUN水平比较(ni=15;±s)

表1　各组大鼠缺血再灌注各时间点血清SCr和BUN水平比较(ni=15;±s)

q检验:与A组比较##P＜0．01;与B组比较＊＊P＜0．01;与C组比较△P＜0．05，△△P＜0．01

分组　SCr/(μmol/L) BUN/(mmol/L) 4 h　12 h　24 h A组　52．04±4．91　54．09±5．73　54．12±5．27　5．45±0．62 4 h　12 h　24 h＊＊　86．88±3．51##＊＊　91．97±9．49##＊＊　9．20±0．86##＊＊　12．37±1．94##＊＊　21．62±5．43##＊＊D组　61．94±3．49##＊＊　94．25±6．66##＊＊△△101．71±8．27##＊＊△　8．48±1．06##＊＊　16．11±1．13##＊＊△△　30．26±4．91##＊＊△F 61．96　193．73　110．51　75．19　208．89　107．02 P ＜0．01　　＜0．01　　＜0．01　　＜0．01　　＜0．01　　＜0．01 MS组内5．52±0．48　5．54±1．04 B组　74．20±6．55##　103．83±7．41##　126．50±17．44##　12．53±2．12##　22．90±3．14##　44．28±9．63##C组　59．96±1．49##20．353　36．104　122．595　1．686　3．783　36．853

3　讨论

在临床工作中，各种急性创伤、休克以及肾脏手术(肾移植、肾部分切除、肾切开取石等)过程中，肾脏几乎不可避免地会发生缺血再灌注损伤，其不仅能够引起移植肾功能的延迟恢复，也可能导致早期的移植肾功能衰竭，导致手术失败，甚至威胁患者生命。缺血再灌注损伤是在肾细胞遭受缺血坏死后，经历再灌注过程激活并释放过量炎性介质，同时产生大量氧自由基，对肾脏造成二次打击，从而加重肾脏损伤［2］。姜黄素是从姜黄的根茎中提取出来的一种酚类化合物，对感染、肿瘤及心血管疾病等均有一定的药理作用［3－5］。近年来，姜黄素在肾脏缺血再灌注保护方面具有良好的应用前景，并已成为研究的热点。国内外研究［6－7］认为，姜黄素对于肾脏保护的机制可能为: (1)通过抑制炎性细胞因子的过度释放和级联反应缓解肾脏的炎性和组织纤维化损害; (2)通过抗氧化作用减少活性氧的生成; (3)可能通过诱导HO-1的表达发挥抗炎、抗氧化和抑制凋亡等作用。

表2　各组大鼠缺血再灌注各时间点血清TNF-α和HO-1水平比较(ni=15;±s)

表2　各组大鼠缺血再灌注各时间点血清TNF-α和HO-1水平比较(ni=15;±s)

q检验:与A组比较##P＜0．01;与B组比较* P＜0．05，＊＊P＜0．01;与C组比较△P＜0．05，△△P＜0．01

分组　TNF-α/(pg/mL) HO-1/(ng/mL) 4 h　12 h　24 h A组　14．05±1．11　13．92±0．80　13．80±0．76　0．28±0．03 4 h　12 h　24h＊＊　19．98±1．35##＊＊　25．37±1．53##＊＊　0．89±0．03##＊＊　1．04±0．07##＊＊　1．25±0．07##＊＊D组　18．49±0．86##0．27±0．05　0．29±0．02 B组　20．30±0．77##　27．53±0．98##　32．33±1．79##　0．62±0．05##　0．79±0．07##　0．98±0．02##C组　16．69±0．57##＊△△　22．12±0．90##＊＊△△　27．77±1．11##＊△　0．78±0．03##＊△△　0．90±0．02##＊△△　1．09±0．09##＊△F 147．59　448．92　508．10　815．67　533．23　778．37 P ＜0．01　　＜0．01　　＜0．01　　＜0．01　　＜0．01　　＜0．01 MS组内0．722　1．058　1．839　0．001　0．003　0．003

表3　各组大鼠缺血再灌注各时间点血清ICAM-1和MPO水平比较(ni=15;±s)

表3　各组大鼠缺血再灌注各时间点血清ICAM-1和MPO水平比较(ni=15;±s)

q检验:与A组比较##P＜0．01;与B组比较＊＊P＜0．01;与C组比较△△P＜0．01

分组　ICAM-1/(pg/mL) MPO/(U/g) 4 h　12 h　24 h 4 h　12 h　24 h A组　67．04±5．32　68．57±3．44　71．05±7．02　1．22±0．141．29±0．10　1．29±0．09 B组　152．07±6．10##　351．90±8．41##　522．24±21．95##　3．25±0．64##　8．08±0．53##　14．27±1．15##C组　122．39±4．46##＊＊　207．62±15．54##＊＊　278．08±10．18##＊＊　2．28±0．08##＊＊　5．19±0．46##＊＊　9．32±0．67##＊＊D组　130．03±5．33##＊＊△△222．04±9．26##＊＊△△295．72±9．76##＊＊△△　2．35±0．06##＊＊　5．90±0．32##＊＊△△　10．71±0．76##＊＊△△F 689．14　1965．00　2795．63　94．23　794．96　765．36 P ＜0．01　　＜0．01　　＜0．01　　＜0．01　　＜0．01　　＜0．01 MS组内28．453　102．45　182．493　0．110　0．151　0．589

由缺血再灌注造成的急性肾衰竭可表现为多种形式，如氮质血症、肾组织的坏死和凋亡等。本实验B组SCr、BUN水平明显增高，而C组较B组损伤轻微。说明缺血再灌注能造成肾脏损害，而姜黄素对肾功能损害具有一定的保护作用。

在炎症反应过程中，TNF-α激活中性粒细胞，使其释放炎性介质而发挥作用。研究［8］证明TNF-α可引起内皮细胞和白细胞表面黏附分子的过表达，从而增强中性粒细胞的激活、聚集以及黏附过程。因此它在缺血再灌注过程中具有重要作用。在组织损伤的早期阶段，中性粒细胞即参与了组织的炎症反应，其作用是通过黏附分子发生的。ICAM-1作为一种重要的黏附分子，可与中性粒细胞相应的表面受体结合，从而促进中性粒细胞的迁徙。有研究［9－10］认为，ICAM-1介导了损伤组织的炎性细胞浸润过程，促进炎症反应的发生，并且参与了肾缺血再灌注损伤过程。本实验中B组大鼠血清TNF-α 和ICAM-1表达水平在各时间点均较其余各组明显增高，且随着时间的延长表达增加，其中D组和C组较B组的增高幅度小，表明姜黄素可以明显缓解肾缺血再灌注损伤时炎症反应，从而减轻肾脏损害。

MPO是中性粒细胞的标志性酶，通过催化过氧化氢和次氯酸盐等强氧化物产生氧自由基，从而杀灭细胞内外的微生物以及其他多种靶物质。MPO的表达及活性能够反映组织的炎症状态。过量的MPO亦可导致机体过度的氧化应激，造成组织的损伤［11－12］。尽管机体对MPO表达及活性调控的生理机制仍不明确，但在机体炎症反应中的调控作用已被学者［13－14］所接受。同时，MPO除在调节炎症过程中发挥作用外，研究［15－16］认为与心血管疾病、肿瘤等疾病相关。本研究中，我们选择观察肾组织中MPO活性的变化，以反映组织炎症及氧化损伤的程度，结果显示，B组大鼠肾组织内MPO活性显著增加，C组MPO活性较A组升高，但较B组表达降低，表明姜黄素不仅可以减轻炎症反应，同时也可以通过减轻损伤组织的氧自由基而对其产生保护作用。

HO-1是近年备受关注的一种可诱导的细胞内源性抗氧化酶，并已成为防治许多以急、慢性炎症和/或氧化应激损伤为主的重要靶点。目前在全身多个器官应激损伤的研究中均见报道［17－18］。国内外研究［19－20］认为，姜黄素可能通过诱导HO-1的上调而发生抗氧化及抗炎症反应作用。在此实验中，我们同样通过设立HO-1抑制剂D组，探讨姜黄素对肾组织缺血再灌注损伤的保护作用中是否存在HO-1的变化。实验结果可见，与D组比较，C组大鼠各时间点血清HO-1表达增加，说明在缺血再灌注损伤过程中，锌－原卟啉抑制了HO-1的表达。本实验还发现，HO-1表达增加的同时，血清TNF-α、ICAM-1以及MPO活性的表达相应减弱，提示该三者的表达可能与HO-1存在一定的关系，说明在肾缺血再灌注的抗炎症反应及抗氧化过程中，除姜黄素本身的作用外，HO-1也可能发挥了部分的保护作用。对于HO-1的表达机制，可能由于姜黄素的诱导，同时肾损伤本身也可激活HO-1的表达。

综上所述，姜黄素对肾缺血再灌注损伤具有保护作用，能够有效减轻肾组织的炎性及氧化应激损害。HO-1可能为其保护机制之一，但姜黄素诱导HO-1表达的机制以及HO-1与各炎性介质之间的关系尚待进一步的研究。

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(本文编辑马启)

·基础医学·

The protective effect of curcumin on the ischemia-reperfusion injury in rats

XU Wei-qiang1，GUO Yuan-yuan2，GUAN Chao1，FANG Wen-ge1，ZHA Ze-yu1
(1．Department of Urology，The Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233040; 2．Department of Burn and Plastic Surgery，The Third People's Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 201999，China)

［Abstract］Objective: To investigate the effects and its mechanism of curcumin Cur on ischemia-reperfusion(I/R) injury in rats．Methods: Sixty rats were randomly divided into the sham operation group(group A)，I/R group(group B)，curcumin + I/R group (group C) and Cur + I/R + Zn-protoporphyrin group(group D) (15 rats each group)．group C and D were intraperitoneally injected with 100 mg/kg of curcumin before 5 days of operation，and group C were intraperitoneally injected with 20 μmol/kg of Zn-protoporphyrin before 60 mins of operation．Group A and B were injected with equivalent 0．9% of sodium chloride．Except for group A，the bilateral renal blood vessels in other 3 groups were blocked，and poured into after 60 mins．The levels of serum creatinine(SCr)，blood urea nitrogen(BUN)，tumor necrosis factor-α(TNF-α)，heme oxygenase-1(HO-1)，intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1) in 4 groups were measured after 4 h，12 h and 24 h of reperfusion．The kidney tissue was excised，and the levels of myeloperoxidase (MPO) activity in excised kidney tissue was measured．Results: The expression levels of SCr，BUN，TNF-α，ICAM-1 and MPO in group C and group D were higher and lower than those in group A and group B，respectively(P＜0．05 to P＜0．01)．The expression levels of HO-1 in group C and group D were lower and higher than that in group A and group B，respectively(P＜0．05 to P＜0．01)．The expression levels of TNF-α and ICAM-1 at each time-points in group D were higher than that in group C(P＜0．05 to P＜0．01)．The expression levels of SCr and BUN in serum，and MPO in kidney tissue in group D at 12 h and 24 h were higher than that in group C (P＜0．05 to P＜0．01)，the differences of whose at 4 h were not statistically significant(P＞0．05)，the level of HO-1 at each time-points in group D was lower than that in group C(P＜0．05 to P＜0．01)．Conclusions: Curcumin can protect the kidneys against I/R injury，and effectively relieve the inflammatory reaction and oxidative stress of kidney tissue．HO-1 may be involved in the renal protective mechanism of curcumin．

［Key words］curcumin; ischemia-reperfusion; heme oxygenase-1; rat

［通信作者］关超，硕士研究生导师，主任医师，副教授．E-mail: 13905526516@163．com

［作者简介］徐卫强(1981－)，男，硕士，主治医师．

［基金项目］蚌埠医学院科学研究项目(Byky1379)

［收稿日期］2015-05-11

［文章编号］1000-2200(2016) 01-0016-04

［中图法分类号］R 282．71

［文献标志码］A

DOI:10．13898/j．cnki．issn．1000-2200．2016．01．004