针刺预处理对大鼠小脑浦肯野细胞缺血性损伤的影响

黄　丽，王　春，赵士弟



针刺预处理对大鼠小脑浦肯野细胞缺血性损伤的影响

黄丽1，王春2，赵士弟1

［摘要］目的:研究针刺预处理百会穴+双侧足三里穴对脑缺血诱导的大鼠小脑浦肯野细胞损伤的影响。方法:将雄性SD大鼠30只随机分为正常对照组、针刺百会穴+双侧足三里穴组(针刺穴位组)和针刺非穴位组，各10只。采用糖氧剥夺的脑缺血模型，观察针刺预处理治疗后大鼠小脑浦肯野细胞的存活率，检测小脑组织中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。结果:与正常对照组比较，针刺非穴位组大鼠脑缺血后浦肯野细胞死亡率明显增加，MDA水平明显增高，SOD活性明显降低(P＜0．01) ;与针刺非穴位组比较，针刺穴位组大鼠小脑浦肯野细胞存活率明显增加，小脑组织中MDA含量明显降低，SOD活性明显增加(P＜0．01)。结论:针刺百会穴+双侧足三里穴对大鼠小脑浦肯野细胞缺血性损伤具有一定的保护作用，其机制可能与小脑组织中活性氧的生成减少和清除增加有关。

［关键词］脑缺血;百会穴;足三里穴;浦肯野细胞;丙二醛;超氧化物歧化酶;大鼠

［作者单位］1．蚌埠医学院病理生理学教研室，安徽蚌埠233030; 2．蚌埠医学院第二附属医院内分泌科，安徽蚌埠233040

缺血性脑血管疾病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是严重危害人类健康的常见病和多发病。临床上采取的很多治疗措施如应用谷氨酸受体阻断剂、低温疗法等，虽然有一定的神经保护作用，但均不能完全改善由脑缺血导致的共济失调和震颤等症状［1］。小脑性共济失调和震颤与浦肯野细胞密切相关［2－3］。临床研究［4－5］表明，针刺疗法在治疗ICVD方面发挥着越来越重要的作用。针刺预处理是指在脑缺血前给予针刺，从而对缺血后的脑组织产生保护作用的现象。研究［6－7］表明，针刺预处理可以明显地改善脑血液循环，增加脑血流量，减轻脑细胞水肿，但其具体机制尚未完全明确。本实验采用糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation，OGD)的脑缺血模型，观察针刺预处理百会穴+双侧足三里穴对大鼠小脑浦肯野细胞存活率、小脑组织中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响，从自由基的角度探讨针刺预处理对大鼠小脑浦肯野细胞缺血性损伤的保护机制，为改善ICVD患者的预后提供一定的实验和理论参考依据。

1　材料与方法

1．1实验动物雄性SD大鼠30只，由安徽医科大学实验动物中心提供，体质量(240±10) g，实验前适应性饲养观察1周。

1．2试剂与设备MDA、SOD测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。NaCl、KCl、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4、dextrose、HEPES、KOH、EGTA、Mg2 +-ATP、Tris-GTP、葡萄糖酸钾、NaOH均为Sigma公司产品; 95% O2和5% CO2购自合肥巨网气体有限公司;振荡切片机(美国VIBRATOME公司)。

1．3溶液配制［8］人工脑脊液A组成(mmol/L) : 124 NaCl，3 KCl，1．3 NaH2PO4，26 NaHCO3，10 dextrose，5 HEPES，0．5 CaCl2和4 MgSO4; pH 7．35～7．45(1 mol/L NaOH调节pH)。人工脑脊液B组成(mmol/L) : 124 NaCl，3 KCl，1．3 NaH2PO4，26 NaHCO3，10 dextrose，5 HEPES，2．4 CaCl2和1．3 MgSO4，pH 7．35～7．45 (1 mol/L NaOH调节pH)。

1．4脑片制备大鼠腹腔注射20 g/L戊巴比妥0．1 mL麻醉，断头取出小脑，在充分氧合(通95% O2和5% CO2混合气体)的冰水混合的人工脑脊液A中将小脑蚓部制备成400 μm脑片，然后迅速转移至充分氧合的人工脑脊液B，在31°C条件下孵育［8］。

1．5体外OGD脑缺血模型制备［9－10］将大鼠小脑脑片转移至无氧(通95% N2和5% CO2混合气体)无糖的人工脑脊液B培养液中培养0．5 h模拟缺血，制备OGD脑缺血模型。

1．6实验分组30只大鼠随机分为正常对照组、针刺百会穴+双侧足三里穴组(针刺穴位组)和针刺非穴位组各10只。

1．6．1正常对照组未作针刺预处理的大鼠。脑片以充分氧合的人工脑脊液B培养2 h。

1．6．2针刺穴位组针刺部位选择百会穴和足三里穴［11］。大鼠于适应性饲养观察1周后给予针刺预处理。两人配合操作，一人抓取活体大鼠以固定，另一人以0．25 mm×25 mm毫针向百会穴平刺约3 mm，同时用0．25 mm×40 mm毫针向双侧足三里穴直刺约5 mm，每天2次，间歇5 min捻转1次，每次持续30 min，连续刺激7 d后大鼠被断头取脑，制备成脑片。脑片先以充分氧合的人工脑脊液B培养1．5 h，再转移至OGD液培养0．5 h。

1．6．3针刺非穴位组针刺部位选择头部与腿部的各1个非穴位点。针刺方法、持续时间、脑片处理与针刺穴位组一致。

1．7检测指标

1．7．1形态学指标缺血后的脑片置于4 %甲醛溶液中4℃保存24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，取脑片内部组织做病理切片(距边缘约100 μm组织以排除在脑片制备中直接受损的区域)，并进行苏木精－伊红(HE)染色，检测浦肯野细胞存活率(即其未受损细胞百分比)。有下列特征之一则视为受损:细胞肿胀、空泡化或细胞固缩核深染［12］。脑片的每个区域至少有50个浦肯野细胞被计数或3个区域总计数＞150个［9］。

1．7．2生化检测MDA含量及SOD活性取上述实验各组大鼠小脑组织，匀浆后按照试剂盒说明书进行操作。

1．8统计学方法采用方差分析和q检验。

2　结果

2．1针刺百会穴+双侧足三里穴对小脑浦肯野细胞形态学的影响正常对照组小脑浦肯野细胞胞膜清晰完整，无肿胀，无变性坏死，核仁清晰;针刺非穴位组可见浦肯野细胞及胶质细胞肿胀、变性坏死，细胞核固缩，细胞体皱缩变形，间质水肿明显;而针刺穴位组细胞损伤则较针刺非穴位组明显减轻，仅有轻度水肿，细胞膜完整清晰，核仁明显(见图1～3)。2．2 3组大鼠小脑浦肯野细胞存活率、小脑组织中MDA和SOD活性比较与正常对照组比较，针刺非穴位组大鼠脑缺血后浦肯野细胞的存活率明显降低(P＜0．01) ;与针刺非穴位组比较，针刺穴位组浦肯野细胞的存活率明显增加(P＜0．01) ;与正常对照组比较，针刺非穴位组大鼠脑缺血后可使小脑组织中MDA水平明显增高，SOD活性明显降低(P＜0．01) ;与针刺非穴位组比较，针刺穴位组大鼠小脑组织中MDA含量明显降低，SOD活性明显增加(P＜0．01) (见表1)。

表1　3组大鼠小脑浦肯野细胞存活率和小脑组织中MDA及SOD活性比较(±s)

表1　3组大鼠小脑浦肯野细胞存活率和小脑组织中MDA及SOD活性比较(±s)

q检验:与正常对照组比较＊＊P＜0．01;与针刺非穴位组比较▲▲P＜0．01

分组　n　　细胞存活率/% MDA/ (mmol/100 mg prot) SOD/ (U/mg prot)正常对照组10　 83．89±4．51　 3．64±0．29　 38．21±3．04针刺非穴位组　10　 37．20±3．24＊＊　6．28±0．34＊＊　21．57±2．05＊＊针刺穴位组　10　 64．14±3．60＊＊▲▲　3．87±0．40▲▲　33．05±2．60＊＊▲▲F　　—　376．25　178．35　107．73 P　　—　　＜0．01　　＜0．01　　＜0．01 MS组内　　—14．599　0．120　6．735

3　讨论

ICVD是危害人类健康的常见病和多发病，具有发病率高、致残率高和死亡率高的特点，给社会和家庭带来极大的负担，其预防与治疗一直是医学界的重要课题之一。目前对于ICVD临床上尚无十分有效的方法。近年来国外［13］研究的焦点集中在尽早恢复和改善缺血脑组织的血供以及保护神经细胞的功能等方面。

自1990年KITAGWA等［14］提出脑缺血预处理的概念以来，缺血预处理理论得到了学者的广泛关注。缺血预处理可以通过激发机体自身的机制减轻一次或多次脑缺血所产生的损伤。近年来的研究［15］表明，缺血、缺氧、亚低温甚至某些药物均可作为预处理的手段，诱导脑缺血耐受的发生。但是由于大多数预处理手段的损伤性较大，因此决定了它们只能作为机制探讨的手段而无法作为一种脑缺血前的预防措施直接应用于临床。针刺疗法作为中医学的重要组成部分之一，在古代就有了防止脑中风的相关记载。中医针刺疗法具有相对安全、损伤小和操作简单方便等优点。近年研究［4－5］表明，中医针刺疗法在治疗ICVD方面发挥着越来越重要的作用。因此，研究针刺预处理特定穴位对增加脑细胞对缺血的耐受机制可能具有非常重要的临床应用价值。

本实验以百会、足三里为针刺预处理用穴。百会穴位居颠顶，其深处即为脑，且为督脉经穴，督脉也归属于脑，可见百会穴与脑联系密切，是调节大脑功能的重要穴位。足三里穴位是“足阳明胃经”的主要穴位之一，有学者［6－7］研究证实，针刺足三里穴可以促进脑细胞功能的恢复，提高神经细胞的工作能力。因此，本实验针刺预处理的主穴选择百会穴和双侧足三里穴。实验采用OGD的缺血模型，通过移除培养液中的葡萄糖和氧气模拟脑缺血，其实验结果类似在体动物模型，并可选择特定类型的细胞进行研究，是神经科学研究中常用的脑缺血实验模型［9－10］。

研究［15］表明，细胞内自由基损害是脑缺血损伤的重要发病机制之一。本实验通过观察针刺百会穴+双侧足三里穴对大鼠小脑浦肯野细胞存活率、小脑组织中MDA的含量和SOD活性的影响，从自由基的角度对针刺预处理后缺血性小脑浦肯野细胞损伤的保护机制进行探讨。SOD是机体内重要的抗氧化酶，是清除自由基的首要物质，它可对抗因氧自由基对细胞造成的损伤，修复受损细胞，在机体的氧化与抗氧化平衡中起着极其重要的作用，其活性的高低也间接反映了机体清除氧自由基的能力。脑组织中富含脂质，当脑缺血性损伤时，机体产生大量的氧自由基，后者使脂质过氧化，产生脂质过氧化产物，如MDA等。因此，测定小脑组织中MDA含量可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映脑细胞损伤的程度。

本实验结果显示，与正常对照组比较，针刺非穴位组的大鼠脑缺血后可使小脑浦肯野细胞的死亡数明显增加，细胞存活率降低，MDA水平明显增高，SOD活性明显降低(P＜0．01) ;与针刺非穴位组相比，针刺穴位组大鼠小脑浦肯野细胞存活数明显增加，细胞存活率增加，小脑组织中MDA含量明显降低，SOD活性明显增加(P＜0．01)，表明针刺预处理百会穴+足三里穴可以通过减少神经细胞膜脂质过氧化的程度，减轻脑缺血导致的细胞内外环境的紊乱，稳定细胞膜、细胞器膜及其功能，使神经细胞的功能得以维持，同时可以提高机体酶促抗氧化防御系统的功能，增加其清除氧自由基的能力来保护脑缺血导致的小脑浦肯野细胞的损伤。

综上所述，针刺百会穴+双侧足三里穴对大鼠小脑浦肯野细胞的缺血性损伤具有一定的保护作用，其机制可能与小脑组织中活性氧的生成减少和清除增加有关。

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(本文编辑马启)

·基础医学·

Influence of acupuncture pretreatment on ischemia-induced functional impairment of cerebellar Purkenje cells in rats

HUANG Li1，WANG Chun2，ZHAO Shi-di1

(1．Department of Pathophysiology，Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233030; 2．Department of Endocrinology，The Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu Anhui 233040，China)

［Abstract］Objective: To investigate the influence of acupuncture pretreatment Baihui-point and bilateral Zusanli-point on ischemiainduced impairment of cerebellar Purkenje cells．Methods: Thirty male SD rats were randomly divided into three groups: control group，acupuncture pretreatment in Baihui-point and bilateral Zusanli-point group and pretreatment in non acupuncture point group，10 rats in each group．The oxygen-glucose deprivation model was established，the survival rate of Purkinje cells，malondiadehyde(MDA) content and superoxide dismutase(SOD) activity were detected during the ischemia period after the rats were acupunctured．Results: Compared with the control，the survival rate of Purkinje cells was lower，MDA content was increased and SOD activity was decreased significantly in non-acupuncture pretreatment group(P＜0．01)．Compared with the non-acupuncture pretreatment group，the survival rate of Purkinje cells was increased，MDA content was decreased，and SOD activity was increased in the acupuncture pretreatment in Baihui-point and bilateral Zusanli-point group(P＜0．01)．Conclusions: Acupuncture pretreatment to Baihui-point and bilateral Zusanli-point prevented ischemia-induced functional impairment of cerebellar Purkenje cells，the protective mechanism may be related to reduce the production of reactive oxygen species and promote the clearance in cerebellar Purkenje cells．

［Key words］ischemia; Baihui-point; Zusanli-point; Purkenje cells; malondiadehyde; superoxide dismutase; rat

［通信作者］赵士弟，硕士研究生导师，教授．E-mail: zhsdi@126．com

［作者简介］黄丽(1982－)，女，硕士，讲师．

［基金项目］安徽省科技厅自然科学基金项目(1308085QH147; 1408085MH185) ;蚌埠医学院自然科学研究项目(Byky1252)

［收稿日期］2014-11-26

［文章编号］1000-2200(2016) 01-0007-04

［中图法分类号］R 743．31

［文献标志码］A

DOI:10．13898/j．cnki．issn．1000-2200．2016．01．002