表柔比星联合多西他赛新辅助化疗对乳腺癌患者癌组织Ki-67表达的影响及意义

冯宇，赵霞，吕淑贞，穆颖，王丹丹，李艳萍

(首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京100038)

表柔比星联合多西他赛新辅助化疗对乳腺癌患者癌组织Ki-67表达的影响及意义

冯宇，赵霞，吕淑贞，穆颖，王丹丹，李艳萍

(首都医科大学附属北京世纪坛医院，北京100038)

目的 探讨表柔比星联合多西他赛新辅助化疗对乳腺癌患者癌组织Ki-67表达的影响及意义。方法 选择行乳腺癌根治术的乳腺癌患者86例，术前均予表柔比星联合多西他赛新辅助化疗。化疗前及化疗后采用定量PCR法及Western blotting法检测癌组织(化疗前取穿刺活检组织，化疗后取手术切除组织)Ki-67 mRNA及蛋白表达。术后随访5年，采用Kaplan Meire生存曲线法统计无病生存期(DFS)、总生存期(OS)，采用Cox比例风险回归模型分析DFS、OS与乳腺癌组织Ki-67表达的关系。结果 化疗后乳腺癌组织Ki-67 mRNA及蛋白表达较化疗前均降低(P均<0.05)。根据化疗前后Ki-67 mRNA表达的变化量，以下调10%为临界值，86例患者中Ki-67 mRNA下调≥10%者57例、下调<10%者39例，其DFS分别为36、22个月，OS分别为45、37个月，二者比较P均<0.01。乳腺癌组织Ki-67表达是乳腺癌患者DFS和OS独立影响因素(HR分别为1.807、1.768，P均<0.05)。结论 表柔比星联合多西他赛新辅助化疗可下调乳腺癌患者癌组织Ki-67表达，而Ki-67表达与患者预后有关。

乳腺癌；新辅助化疗；表柔比星；多西他赛；Ki-67

近年来，我国乳腺癌的发病率呈逐年升高趋势，增长速度超过全球平均水平[1，2]。新辅助化疗是指在手术治疗或放疗前进行的系统性细胞毒性药物治疗，是局部晚期乳腺癌的常用治疗方法，旨在缩小病灶、提高手术切除率，消除或减少转移灶，防止远处转移，提高保乳率、延长生存期等[3,4]。目前，新辅助化疗已应用于ⅡA或ⅡB期乳腺癌患者。Ki-67是增殖细胞核抗原，在多种恶性肿瘤组织中表达异常。本研究探讨表柔比星联合多西他赛新辅助化疗对乳腺癌患者癌组织Ki-67表达的影响及意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2009年1月～2012年12月我院收治的乳腺癌患者86例，均行乳腺癌根治术及新辅助化疗；年龄28～67岁，中位年龄45岁；有乳腺癌家族病史16例；均有淋巴结转移，转移淋巴结<4个45例，≥4个41例；组织学分级：Ⅰ级4例，Ⅱ级60例，Ⅲ级22例；分子亚型：Luminal A型13例，Luminal B型46例，HER2过表达型15例，三阴型12例。纳入标准：年龄≥18岁；经组织病理检查确诊为乳腺终末导管小叶单元上皮来源恶性肿瘤；肿瘤分期为局部晚期或未达局部晚期但根治术前行新辅助化疗者。排除标准：伴发其他脏器恶性肿瘤者；接受其他化疗药物者；新辅助化疗失败，远处转移无法手术者；未采用本化疗方案或曾中断化疗者；乳腺癌根治术外采用其他术式者。

1.2 治疗方法 患者入院后完善相关检查，3天后开始新辅助化疗，化疗方案中包含表柔比星、多西他赛。4例Luminal A型患者给予TE方案：表柔比星75 mg/m2静滴，多西他赛75 mg/m2静滴；9例Luminal A型患者给予TEC方案：表柔比星 60 mg/m2静滴，多西他赛75 mg/m2静滴，环磷酰胺500 mg/m2静滴；Luminal B型及HER-2过表达型患者均给予EC-T方案：表柔比星 75 mg/m2静滴，环磷酰胺600 mg/m2静滴，多西他赛100 mg/m2静滴；三阴型患者均给予CEF-T方案：表柔比星 75 mg/m2静滴，环磷酰胺600 mg/m2静滴，5-Fu 600 mg/m2静滴，多西他赛100 mg/m2静滴。21天为一疗程，均治疗4个疗程。化疗前30 min肌注异丙嗪25 mg、苯海拉明20 mg，静推地塞米松10 mg及5 mg/mL盐酸托烷司琼以对抗化疗的毒副反应。每2周行乳腺B超观察肿瘤体积变化，并选择适宜时机行乳腺癌根治术。

1.3 相关指标观察

1.3.1 乳腺癌组织 Ki-67表达 ①Ki-67 mRNA表达：采用实时定量PCR法。取化疗前后乳腺癌组织标本(化疗前取穿刺活检组织，化疗后取手术切除组织)。采用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测样本浓度和纯度，经逆转录试剂盒逆转录为cDNA。Ki-67引物序列：上游引物5′-CCAGAACTAACAGACACTGCCACG-3′，下游引物5′-GCCCTCATCACCGCTTGCT-3′；内参照GAPDH引物序列：上游引物5′-AAATCAAGTGGGGCGATGCTG-3′，下游引物5′-GCAGAGATGATGACCCTTTTG-3′。采用PRISM 7500实时定量PCR仪扩增引物。反应体系25 μL，包括SYBR premix(2×)12.5 μL，目的基因上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL；反应条件：94 ℃ 4 min，95 ℃ 40 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，循环35次，72 ℃ 1 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，采用2-ΔΔCt计算Ki-67 mRNA的相对表达量。② Ki-67 蛋白表达：采用Western blotting法。取化疗前后乳腺癌组织标本，提取组织蛋白，经SDS-PAGE浓缩胶及分离胶电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，Ki-67一抗孵育，洗膜3次，二抗孵育，显色。以GAPDH为内参照，采用Fluorchem软件分析蛋白条带，以目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.3.2 乳腺癌患者无病生存期(DFS)、总生存期(OS) 术后随访5年，中位随访时间51.5个月，明确患者肿瘤复发情况及生存状况。采用Kaplan Meire生存曲线法统计DFS和OS。

2 结果

化疗后乳腺癌组织Ki-67 mRNA及蛋白表达均较化疗前降低(P均<0.05)，见表1。根据化疗前后Ki-67 mRNA表达的变化量，以下调10%为临界值，57例Ki-67 mRNA下调≥10%、39例下调<10%，二者DFS分别为36、22个月，OS分别为45、37个月，二者比较P均<0.01。Cox比例风险回归模型分析显示，Ki-67表达是乳腺癌患者DFS和OS独立影响因素(HR分别为1.807、1.768，P均<0.05)。

表1 化疗前后乳腺癌组织Ki-67 mRNA及蛋白相对表达量比较

注：与化疗前比较，*P<0.05。

3 讨论

蒽环及紫杉类药物是乳腺癌一线化疗药物，其中蒽环类药物作为乳腺癌联合化疗的基石，几乎包含在所有的术前化疗方案中；紫杉类药物可使新辅助化疗的有效率提高75%～80%。联合应用蒽环及紫杉类药物可为乳腺癌新辅助化疗提供更为可靠的临床疗效。但目前其具体作用机制及靶向因子仍不明确。

恶性肿瘤的发生、发展均离不开细胞的异常增殖。增殖细胞核抗原Ki-67是一种与细胞增殖密切相关的核蛋白，是较为明确的与肿瘤细胞增殖相关的因子[5]，与多种肿瘤的转移及患者预后相关。万安等[6]研究证实，Ki-67高表达与子宫颈癌局部侵袭及淋巴结转移相关。在乳腺癌分子分型中，肿瘤组织中Ki-67阳性表达率是Luminal A型和B型的区分依据。有研究指出，Ki-67可能是乳腺癌新辅助化疗及内分泌治疗的分子靶点之一[7]。对宫颈鳞癌的研究发现，Ki-67表达水平有助于判定肿瘤细胞的生物学行为[8,9]。Ki-67相对低表达的化疗患者化疗期间毒副反应发生率降低[10,11]。

本研究结果显示，表柔比星及紫杉类方案新辅助化疗后乳腺癌组织Ki-67 mRNA和蛋白表达较化疗前均下降，与多种实体肿瘤中Ki-67的表达情况一致。Ki-67高表达可促进肿瘤增殖及转移活性，与肿瘤分子分型、淋巴结转移、肿瘤分化程度以及ER、PR负性表达相关[12]。本研究Ki-67 mRNA下调≥10%者DFS、OS均长于下调<10%者；进一步研究发现，Ki-67表达是乳腺癌患者DFS和OS的独立影响因素；提示Ki-67可作为乳腺癌患者预后的预测因子，Ki-67高表达导致肿瘤增殖、侵袭力升高可能是其作用机制[13]。

综上所述，表柔比星联合多西他赛新辅助化疗可下调乳腺癌患者癌组织Ki-67表达，而Ki-67表达与患者预后有关。

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Effect of neoadjuvant chemotherapy with docetaxel and epirubicin on Ki-67 expression in patients with breast cancer

FENGYu,ZHAOXia,LYUShuzhen,MUYing,WANGDandan,LIYanping

(BeijingShijitanHospitalAffialtedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100038,China)

Objective To investigate the effect of neoadjuvant chemotherapy with epirubicin and docetaxel on Ki-67 expression in patients with breast cancer and its significance. Methods Eighty-six cases of patients with breast cancer treated with breast cancer radical surgery were selected in this study, epirubicin combined with docetaxel neoadjuvant chemotherapy were carried out before operation. Quantitative PCR and Western blotting were used to detect the expression of Ki-67 mRNA and protein before and after chemotherapy. After 5-year follow-up, we used Kaplan-meire survival curve method to analyze disease-free survival (DFS) and overall survival (OS), used Cox proportional hazard regression model to analyze the relationship between DFS, OS and Ki-67 expression. Results The expression of Ki-67 mRNA and Ki-67 protein in the breast cancer after chemotherapy were lower than that before chemotherapy (allP<0.05). According to Ki-67 mRNA expression changes, patients were further divided into higher change group (down-regulation of Ki-67 mRNA was more than or equal to 10%, 57 cases) and lower change group (Ki-67 mRNA reduced less than 10%, 39 cases). DFS of the two groups (higher and lower changes group respectively) was 36, 22 months and OS was 37, 45 months, and there were significant differences between the two groups (allP<0.01). Ki-67 was the an independent influencing factor for DFS and OS in patients with breast cancer (HR were 1.807, 1.768, allP<0.05). Conclusion Epirubicin and docetaxel neoadjuvant chemotherapy can down-regulate the expression of Ki-67 in tumor tissues of patients with breast cancer, and the high expression of Ki-67 is related to the poor prognosis.

breast carcinoma; neoadjuvant chemotherapy； epirubicin; docetaxel; Ki-67

李艳萍(E-mail： lyp671102@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.024

R562

B

1002-266X(2016)24-0063-03

2016-01-12)