孟鲁司特对哮喘大鼠气道炎症的调控作用及其机制

邓俊，杨艳，梁宇佳，熊瑛，王宋平，熊彬

(四川医科大学附属第一医院，四川泸州646000)

孟鲁司特对哮喘大鼠气道炎症的调控作用及其机制

邓俊，杨艳，梁宇佳，熊瑛，王宋平，熊彬

(四川医科大学附属第一医院，四川泸州646000)

目的 观察孟鲁司特对哮喘大鼠气道炎症的调控作用，并探讨其可能的作用机制。方法 将30只雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、孟鲁司特组、地塞米松组和联合用药组，每组6只。对照组腹腔注射和雾化吸入生理盐水，其余各组均采用卵清白蛋白腹腔注射致敏及雾化吸入激发的方法制备哮喘模型。孟鲁司特组、地塞米松组每次激发前分别给予孟鲁司特(15 mg/kg)、地塞米松(2 mg/kg)灌胃，联合用药组每次激发前给予等量孟鲁司特和地塞米松灌胃，1次/d，连用10天。收集各组支气管肺泡灌洗液(BALF)，计数WBC、嗜酸性粒细胞(EOS)、中性粒细胞(PMN)、淋巴细胞(LYM)。取右肺组织行HE染色，观察其病理变化，采用免疫组化SP法检测肺组织上皮细胞信号转导子和转录激活子3(STAT3)、瘦素(Leptin)及IL-6表达。结果 与对照组比较，其余各组BLAF中WBC、EOS、PMN、 LYM计数和肺组织STAT3、Leptin、IL-6表达均升高(P均<0.05)；与模型组比较，孟鲁司特组、地塞米松组和联合用药组上述指标均降低，但联合用药组降低更明显(P均<0.05)。对照组肺组织形态正常，模型组有明显的气道炎症病理表现，孟鲁司特组、地塞米松组和联合用药组肺组织病理表现介于对照组和模型组之间，且联合用药组炎性程度轻于孟鲁司特组和地塞米松组。结论 孟鲁司特能减轻哮喘大鼠的气道炎症状态，与糖皮质激素联用具有协同抗炎作用；其抗炎机制可能与抑制肺组织STAT3、Leptin及IL-6表达有关。

哮喘；气道炎症；孟鲁司特；地塞米松；大鼠

支气管哮喘(简称哮喘)是由多种细胞[如嗜酸性粒细胞(EOS)、淋巴细胞(LYM)、中性粒细胞(PMN)]和细胞组分共同参与的气道慢性炎症性疾病。研究表明，瘦素(Leptin)和IL-6具有促进炎症反应和免疫调节作用，信号转导子和转录激活子3(STAT3)在哮喘的发生、发展过程中具有重要作用[1,2]。白三烯受体拮抗剂可通过调节白三烯的生物活性，抑制气道上皮细胞分泌细胞因子和EOS存活而发挥抗炎作用[3,4]。孟鲁司特是临床上常用的白三烯受体拮抗剂，可与糖皮质激素协同发挥抗炎作用，但其具体机制尚未完全阐明[5,6]。为此，我们于2013年8月～2014年8月进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠30只，6周龄，体质量150～200 g，由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，动物许可证号：SCXW(渝)2007-2008。孟鲁司特购自杭州默沙东制药有限公司，地塞米松片购自山西亨瑞达制药有限公司。卵清白蛋白(OVA)购自美国Sigma公司，氢氧化铝干粉购自北京化学试剂三厂，兔抗鼠Leptin免疫组化试剂盒购自美国Santa Cruz公司，兔抗鼠IL-6免疫组化试剂盒购自美国Bioss公司，兔抗鼠STAT3免疫组化试剂盒购自美国Bioworld公司。

1.2 模型制备及分组处理 将30只雄性SD大鼠适应性饲养3天，随机分为对照组、模型组、孟鲁司特组、地塞米松组、联合用药组，每组6只。除对照组外，其余各组分别于造模第1、7天腹腔注射含氢氧化铝200 mg+OVA 100 mg的生理盐水混悬溶液1 mL；造模第15天开始雾化吸入1% OVA 30 mL进行激发，30 min/次，1次/d，连用10天。对照组采用同样方法腹腔注射和雾化吸入等量生理盐水。孟鲁司特组每次激发前1.5 h，将孟鲁司特15 mg/kg溶于10 mL生理盐水中灌胃；地塞米松组每次激发前30 min，将地塞米松2 mg/kg溶于10 mL生理盐水中灌胃；联合用药组采用同样方法给予等量地塞米松和孟鲁司特灌胃，对照组、模型组给予等量生理盐水灌胃。

1.3 相关指标观察

1.3.1 支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞计数 各组于末次激发24 h进行麻醉，常规消毒铺巾，打开腹腔，腹主动脉放血。然后打开胸腔，分离气管及肺叶，结扎右侧肺门，左肺行支气管肺泡灌洗。将针管插入气管并缓慢注入生理盐水2 mL，回抽BALF，重复3次，回收率>85%为合格标本，计数每升BALF中WBC总数。将BALF以1 500 r/min离心10 min，离心沉淀后用1 mL生理盐水重悬，取细胞悬液制作涂片，计数EOS、PMN、LYM。

1.3.2 肺组织病理变化 取各组右肺组织，10%多聚甲醛固定，石蜡包埋，5 μm厚切片。二甲苯脱蜡后，经不同梯度乙醇脱水，苏木素染色5 min，自来水冲洗；盐酸乙醇分化30 s，自来水浸泡15 min，置于伊红染液2 min；乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下(400倍)观察肺组织病理变化。

1.3.3 肺组织Leptin、STAT3及IL-6表达 采用免疫组化SP法。肺组织石蜡包埋、切片，60 ℃烤片1 h，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水。PBS(pH=7.2)冲洗3次×5 min，置于3% H2O2中，37 ℃孵育10 min；0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH=6.0)中煮沸，PBS冲洗3次×5 min。室温滴加山羊血清封闭，37 ℃孵育10 min；加入兔抗鼠一抗，置于湿盒4 ℃孵育过夜，以PBS代替一抗作阴性对照。PBS冲洗3次×5 min，滴加生物素标记羊抗兔二抗，室温静置20 min，PBS冲洗3次×5 min。以辣根过氧化物酶标记链霉素卵白素，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次×5 min；二氨基联苯胺染色，自来水冲洗，苏木素复染2 min。1%盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下阳性细胞呈棕黄色或黄褐色染色。采用双盲法评分，每张切片观察3个高倍镜视野，染色强度评分：无染色为0分、轻度染色为1分、中度染色为2分、强度染色为3分；染色细胞所占比例评分：无细胞染色为0分、<25%为1分、25%～50%为2分、>50%为3分。肺组织Leptin、STAT3及IL-6的表达以染色强度评分和染色细胞所占比例评分之和表示。

2 结果

2.1 各组BLAF中WBC、EOS、PMN、 LYM计数比较 与对照组比较，其余各组BLAF中WBC、EOS、PMN、 LYM计数均升高(P均<0.05)；与模型组比较，孟鲁司特组、地塞米松组和联合用药组BLAF中WBC、EOS、PMN、 LYM均降低，但联合用药组降低更明显(P均<0.05)。见表1。

表1 各组BLAF中WBC、EOS、PMN、 LYM计数比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与孟鲁司特组比较，#P<0.05；与地塞米松组比较，▲P<0.05。

2.2 各组肺组织病理变化 对照组气道上皮完整、无水肿，纤毛无脱落，肺泡腔内未见渗出，气道黏膜下未见炎性细胞浸润，支气管平滑肌未见增厚。模型组气道上皮肿胀，纤毛脱落，杯状细胞增多，黏液分泌增多，细小支气管内可见黏液栓；气道黏膜下可见炎性细胞浸润，肺泡腔内可见炎性渗出，上皮下毛细血管扩张、充血，周围组织水肿。孟鲁司特组、地塞米松组和联合用药组肺组织病理形态介于对照组和模型组之间，且联合用药组炎性程度轻于孟鲁司特组和地塞米松组。见插页Ⅱ图6。

2.3 各组肺组织STAT3、Leptin、IL-6表达比较 与对照组比较，其余各组肺组织STAT3、Leptin及IL-6表达均升高(P均<0.05)；与模型组比较，孟鲁司特组、地塞米松组和联合用药组肺组织STAT3、Leptin及IL-6表达均降低，且联合用药组降低更明显(P均<0.05)。见表2。

表2 各组肺组织STAT3、Leptin、IL-6表达比较(分

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05；与孟鲁司特组比较，#P<0.05；与地塞米松组比较，▲P<0.05。

3 讨论

哮喘的病理特征主要为气道上皮下EOS、LYM、PMN等炎性细胞浸润，气道黏膜下组织水肿，微血管通透性增加，杯状细胞增多，气道黏液分泌增多等[7,8]。本研究模型组肺组织的病理改变与哮喘气道炎症的基本病理特征相符合，表明采用OVA致敏及雾化吸入激发的方法制备大鼠哮喘模型成功。

近年研究表明，气道上皮细胞在哮喘的发病中具有重要作用，气道上皮损伤与气道慢性炎症、气道高反应性和气道重塑密切相关；当气道受到环境激发因子刺激时，气道上皮细胞首先受累，可合成和释放多种炎症介质和细胞因子[9～11]。STAT3是STAT家族的一员，主要介导细胞内外信号的转导。STAT3可启动Th17分化，使气道上皮细胞和平滑肌细胞分泌IL-6等细胞因子，促使中性粒细胞分化，加重气道炎症，在哮喘的发生、发展中具有重要作用[12～14]。Leptin是一种脂肪细胞因子蛋白多肽，其主要作用是调节摄食活动及能量平衡，还可促进炎症反应和调节免疫。Leptin主要与其功能受体瘦素受体b型结合，并通过JAK-STAT3信号途径发挥作用[1,15]。

孟鲁司特是临床常用的白三烯受体拮抗剂，主要通过抑制白三烯的生物活性而发挥抗炎作用，是目前除吸入型糖皮质激素外惟一可单独应用的哮喘控制性药物，也可作为中重度哮喘的联合治疗用药[3,16]，但其抗炎机制尚未完全阐明。有研究发现，孟鲁司特能抑制其他促炎症因子的表达而减轻气道炎症反应[5,6]，抑制EOS诱导的气道上皮间质转化和促纤维化因子TGF-β1表达，从而抑制气道重塑[17,18]。本研究结果显示，孟鲁司特组和地塞米松组气道炎症程度及炎症细胞浸润均轻于模型组，且两者联合用药抗炎效果更好，提示孟鲁司特和糖皮质激素具有协同抗炎作用；与模型组比较，孟鲁司特组、地塞米松组和联合用药组肺组织STAT3、Leptin及IL-6表达均降低，但联合用药组降低更明显，进一步证实孟鲁司特和糖皮质激素具有协同抗炎作用，其抗炎机制可能与其抑制肺组织STAT3、Leptin及IL-6表达有关。

综上所述，孟鲁司特能减轻哮喘大鼠的气道炎症状态，与糖皮质激素联用具有协同抗炎作用；其抗炎机制可能与抑制肺组织STAT3、Leptin及IL-6表达有关。本研究为白三烯受体拮抗剂单独应用或与糖皮质激素联合应用治疗哮喘提供了理论依据。

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四川省卫生厅科研课题(110341)。

王宋平(E-mail: wang4816@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.011

R562.1

A

1002-266X(2016)24-0034-03

2015-10-14)