痰热清注射液辅助化疗对小鼠Lewis肺癌的抑瘤效果及其作用机制

李珍，叶志华，冯娟娟

(河南省人民医院，郑州450008)

·基础研究·

痰热清注射液辅助化疗对小鼠Lewis肺癌的抑瘤效果及其作用机制

李珍，叶志华，冯娟娟

(河南省人民医院，郑州450008)

目的 观察痰热清注射液辅助化疗对小鼠Lewis肺癌的抑瘤效果，并探讨其作用机制。方法 选择C57BL/6小鼠50只，随机分为空白组、模型组、顺铂组、痰热清组及顺铂联合痰热清组。除空白组外，其余组建立Lewis肺癌模型。接种Lewis肺癌瘤株后1天，顺铂组隔天腹腔注射1.5 mg/kg顺铂，痰热清组腹腔注射3.5 mL/kg痰热清注射液，顺铂联合痰热清组腹腔注射等量顺铂、痰热清注射液；空白组、模型组腹腔注射等量生理盐水。各组连续给药2周。测量小鼠接种后5、7、10、14天肿瘤体积，计算肿瘤抑制率。末次给药后，检测股骨骨髓细胞(BMC)计数及外周血WBC、RBC、PLT，并检测小鼠血清血管内皮生长因子(VEGF)、血管抑素(AS)、内皮抑素(ES)、IL-2、TNF-α、IFN-γ水平。结果 接种14天，与模型组比较，顺铂组、痰热清组、顺铂联合痰热清组肿瘤体积缩小(P<0.05或<0.01)，且顺铂联合痰热清组效果更明显。顺铂联合痰热清组肿瘤抑制率明显高于顺铂组和痰热清组(P<0.05或<0.01)。与模型组比较，顺铂联合痰热清组BMC、WBC、RBC、PLT明显降低(P<0.05或<0.01)，但均高于顺铂组、均低于痰热清组(P<0.05或<0.01)。与空白组比较，模型组血清VEGF、TNF-α水平明显升高，AS、ES、IL-2、IFN-γ明显降低(P均<0.01)。与模型组比较，顺铂联合痰热清组血清VEGF、TNF-α明显降低，AS、ES、IL-2、IFN-γ明显升高(P<0.05或<0.01)。与顺铂组比较，顺铂联合痰热清组血清VEGF更低，AS、ES、IL-2更高(P均<0.01)，与痰热清组比较，顺铂联合痰热清组VEGF、TNF-α更高，AS、ES、IL-2、IFN-γ更低(P均<0.01)。结论 痰热清注射液辅助化疗能改善Lewis肺癌小鼠外周血细胞异常，增强免疫功能，抑制肿瘤生长；其机制可能与降低血清VEGF、TNF-α，升高AS、ES、IL-2、IFN-γ水平有关。

肺癌；痰热清注射液；免疫功能；内皮生长因子；血管抑素；小鼠

肿瘤扩散、转移与血管形成有关，其血管形成受体内多种因素调控，如内皮生长因子、血管抑素等[1～3]。痰热清注射液为一种中药制剂，具有清热、化痰、解毒之功效， 临床主要用于风温肺热病痰热阻肺证。研究表明，痰热清注射液在抑制肺癌生长、稳定和控制病灶、延缓复发转移方面有一定的作用[4,5]。2014年2月～2015年8月，我们观察了痰热清注射液联合化疗对小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级C57BL/6小鼠56只，4周龄，雌雄各半，体质量18～22 g，由河北省实验动物中心提供，许可证号：SYXK(冀)2010-0038。Lewis肺癌瘤株，由军事医学科学院提供。LD-5M立式低速冷冻离心机，四川蜀科仪器有限公司；精密移液器，端士Socorex公司；BIO-RAD酶标仪Xmark，美国BIO-RAD伯乐公司；DW-86L626型低温冰箱，青岛海尔股份有限公司。痰热清注射液(批号：1107114)，上海凯宝药业有限公司；顺铂(批号：2030111DB)，齐鲁制药公司；小鼠VEGF试剂盒(批号：HTAC017)、ES试剂盒(批号：HTAC023)、AS试剂盒(批号：HTAC011)、IL-2试剂盒(批号：HTAC012)、TNF-α试剂盒(批号：HTAC009)、IFN-γ试剂盒(批号：HTAC015)，均为ELISA试剂盒，由Andy-gene公司提供。

1.2 模型制备 参照文献[6]方法建立Lewis肺癌小鼠模型。37 ℃温水复苏Lewis肺癌瘤株，调整瘤株密度至1×107/mL。取0.1 mL接种于2只小鼠右腋皮下；接种第11天，将小鼠以脱颈方式处死，取生长良好的癌组织，洗净，剪碎，研磨，调整肿瘤细胞密度至1×107/mL，再次接种于小鼠，重复上述操作。参照上述方法将接种3次的肿瘤细胞接种于40只小鼠右腋皮下。

1.3 动物分组及处理 取荷瘤小鼠40只，随机分为模型组、顺铂组、痰热清组、顺铂联合痰热清组，每组10只。另取未制模小鼠10只作为空白组。接种Lewis肺癌瘤株后1天，顺铂组隔天腹腔注射顺铂1.5 mg/kg；痰热清组腹腔注射痰热清注射液3.5 mL/kg，顺铂联合痰热清组应用顺铂、痰热清注射液，剂量及用法分别同顺铂组及痰热清组；空白组、模型组腹腔注射等量生理盐水。各组连续给药2周。造模过程中或给药过程中部分小鼠死亡，最终空白组、模型组、顺铂组、痰热清组、顺铂联合痰热清组剩余小鼠分别为9、8、7、9、8只。

1.4 相关指标观察

1.4.1 肿瘤体积及抑瘤率 模型组、顺铂组、痰热清组、顺铂联合痰热清组接种后5、7、10、14天，采用动物肿瘤测量跟踪系统，电子数显卡尺测量肿瘤最长径、最短径(cm)，肿瘤体积=肿瘤最长径×最短径×最短径/2，计算肿瘤抑制率=(肿瘤体积-模型组肿瘤体积)/模型组肿瘤体积×100%。

1.4.2 外周血细胞及股骨骨髓细胞(BMC)数量 取小鼠股动脉血0.5 mL，采用流式细胞仪计数外周血WBC、RBC、PLT；待小鼠处死后，剪取小鼠股骨，PBS冲洗骨髓腔，4 000 r/min离心15 min，弃上清，加入PBS混匀。光镜下于计数板上计数单根股骨全部骨髓细胞(BMC)。

1.4.3 血清相关细胞因子检测 取小鼠股动脉血，静置30 min，4 000 r/min离心15 min，取上清，低温保存，备用。采用酶标仪，ELISA法检测外周血血管内皮生长因子(VEGF)、血管抑素(AS)、内皮抑素(ES)、IL-2、TNF-α、IFN-γ水平。严格按试剂盒说明步骤检测。

2 结果

2.1 各组肿瘤体积及抑制率比较 见表1。

表1 各组不同时间肿瘤体积及肿瘤抑制率比较±s)

注：与模型组同时间点比较，#P<0.05，##P<0.01；与顺铂组同时间点比较，△P<0.05，△△P<0.01；与痰热清组同时间点比较，*P<0.05，**P<0.01。与同组接种5天比较，▲▲P<0.01；与同组接种7天比较，○P<0.05；与同组接种10天比较，◆P<0.05。

2.2 各组外周血细胞及BMC数量比较 见表2。

2.3 各组血清相关细胞因子水平比较 见表3。

表2 各组外周血细胞及BMC数量比较±s)

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与顺铂组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与痰热清组比较，◇P<0.05，◇◇P<0.01。

表3 各组血清相关细胞因子水平比较±s)

注：与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；与顺铂组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与痰热清组比较，◇P<0.05，◇◇P<0.01。

3 讨论

肺癌的早期发现率较低，临床上多数患者就诊时病情已属中晚期，治愈率极低。化疗是肺癌的主要治疗方法，90%以上的肺癌需要接受化疗，但化疗除能杀死肿瘤细胞外，对人体正常细胞及免疫功能也有损害[7，8]。近年来，中药复方制剂作为生物调节剂已用于恶性肿瘤的综合治疗，以低毒、廉价、高效等优势受到越来越多的关注。

痰热清注射液的主要成分为黄芩、熊胆粉、山羊角、金银花、连翘等，具有清热、化痰、解毒之功效，可增强机体的免疫功能。痰热清注射液在临床辅助治疗肿瘤方面有一定的成效。耿秀艳等[9]报道，妇科肿瘤老年患者术后给予痰热清注射液雾化吸入可增强患者的免疫功能。杨旭初等[10]报道，肺癌患者应用痰热清注射液可减少放射性肺炎及放射性肺纤维化的发生。李永伟等[11]报道，痰热清注射液可改善原发性肝癌肝动脉栓塞化疗术后患者栓塞综合征的发生，患者发热持续时间缩短。本研究结果显示，接种肿瘤细胞第14天，与模型组比较，顺铂组、痰热清组、顺铂联合痰热清组肿瘤体积均明显缩小，但顺铂联合痰热清组体积明显小于、抑瘤率明显高于顺铂组、痰热清组，提示痰热清注射液具有增强顺铂抑制肿瘤生长的作用。

骨髓是淋巴细胞发育、分化成熟的主要场所之一，与机体的抗肿瘤免疫功能密切相关，在化疗过程中，骨髓极易受到损伤，而骨髓细胞数量可反映机体免疫功能状态及淋巴细胞的发育状态。本研究中，与模型组比较，顺铂联合痰热清组BMC、WBC、PLT、RBC明显降低，但均高于顺铂组、低于痰热清组，提示顺铂联合痰热清能保护化疗小鼠的骨髓，促进淋巴细胞分化、发育及发挥免疫活性，进而增强淋巴细胞的抗肿瘤免疫应答。

IFN-γ是典型的Th1类细胞因子，TNF-α由巨噬细胞及活化T细胞产生，二者均可促进抗原提呈细胞对肿瘤抗原的提呈及细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的识别，在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用[12,13]。IL-2能够诱导干扰素和多种细胞因子的分泌，是免疫调节的中心环节，能促进Fas抗原的表达，促进细胞凋亡[14]。马鸣等[15]研究证实，痰热清注射液对化疗造成的机体免疫功能损伤有明显的保护作用，并对机体抗肿瘤免疫有明显的促进作用。本研究结果显示，与模型组比较，顺铂联合痰热清组血清TNF-α明显降低，IL-2、IFN-γ明显升高；与顺铂组比较，顺铂联合痰热清组的IL-2更高；与痰热清组比较，顺铂联合痰热清组TNF-α更高，IL-2、IFN-γ更低；这说明IFN-γ、TNF-α、IL-2可增强淋巴细胞抗肿瘤免疫活性，从而改善肿瘤患者机体的免疫状态。与痰热清组比较，顺铂联合痰热清组IFN-γ、IL-2更低，TNF-α、VEGF更高，说明痰热清与顺铂二者具有协同作用，联合应用可更好地改善肿瘤患者机体的免疫状态。

血管生成促进因子VEGF主要通过影响血管内皮细胞的 PI3K 等信号通路而发挥调控作用[16]；血管生成抑制因子主要包括AS、ES，AS主要通过抑制肿瘤血管内皮细胞的增殖、迁移来发挥其抗肿瘤作用[17]；而ES具有广泛的抗癌活性，能干扰新的血管生成，是最有效的内源性血管生长抑制剂之一[18]。本研究结果显示， 与顺铂组比较，顺铂联合痰热清组血清VEGF更低，AS、ES更高；与痰热清组比较，顺铂联合痰热清组血清VEGF更高，AS、ES更低；说明顺铂联合痰热清抑制VEGF、上调AS、ES水平的效果优于顺铂。与痰热清组比较，顺铂联合痰热清组血清AS、ES更低，VEGF更高，提示痰热清与顺铂联合抑制肿瘤生长的效果更加明显，两者协同对肿瘤产生抑制作用。

综上所述，热清注射液能够改善Lewis肺癌小鼠外周血细胞异常，增强免疫功能，抑制肿瘤生长，可能与调控血清IL-2、TNF-α、IFN-γ、VEGF、ES及AS水平密切相关。

[1] 肖创清，蒋立，黄志红，等.肺癌患者化疗前后血清ES和CYFRA21-1改变的临床意义[J].湖南师范大学学报(医学版)，2013，10(3)：51-52，55.

[2] 银瑞，董新伟，王铮，等.血管抑素基因治疗Lewis肺癌移植瘤小鼠的疗效研究[J].中华实验外科杂志，2014，31(12)：2768-2769.

[3] 夏晖，张宜明，于长海，等.干扰素γ和γ射线对人肺癌A549细胞联合作用的体外观察[J].中华医学杂志，2012，92(5)：348-350.

[4] 张志华，郑光，郭洪涛，等.痰热清注射液临床应用文献分析[J].中成药，2014，36(1)：52-55.

[5] 冯石芳，王小虎，张秋宁，等.痰热清注射液治疗放射性肺炎的系统评价[J].肿瘤预防与治疗，2012，25(3)：154-159.

[6] 陈超，陈慧彬，滕鸣健，等.扶正散结汤拆方对Lewis肺癌小鼠血清血管内皮生长因子、血管抑素及内皮抑素的影响[J].环球中医药，2015，8(2)：149-153.

[7] 叶青，黄捷晖，张艳，等.联合用药治疗肺癌化疗后肺部感染的临床疗效[J].临床肺科杂志，2014，19(6)：1078-1080.

[8] Underner M, Perriot J, Merson F, et al. Influence of tobacco smoking on quality of life in patients with lung cancer[J]. Rev Mal Respir, 2015,32(6):586-598.

[9] 耿秀艳,梁芳,姬承慧,等.术后痰热清注射液雾化吸入对老年妇科肿瘤患者的疗效及护理体会[J].河北医药,2012,34(15):2388-2389.

[10] 杨旭初,王怀璋,杨峰,等.痰热清注射液对肺癌患者放射性肺炎及放射性肺纤维化的影响[J].中国生化药物杂志,2015,35(1):122-124.

[11] 李永伟,杨宏志,王拥泽,等.痰热清注射液治疗原发性肝癌 TACE 术后栓塞综合征的研究[J].中华临床医师杂志(电子版),2013,7(3):1081-1084.

[12] 李高，蔡仁中，蔡用清，等.肺癌患者血清中IL-2、IFN-γ、TNF-α、NKG2D的表达及临床意义[J].海南医学，2015，26(12)：728-1731.

[13] 张晓双，孙建宁，宋延平，等.复方乌骨藤胶囊对Lewis肺癌小鼠TNF-α、NK活性的影响[J].中国实验方剂学杂志，2013，19(6)：220-223.

[14] 陈慧彬，陈超，滕鸣健，等.扶正散结汤拆方配伍中药对Lewis肺癌荷瘤小鼠血清IL-2、IL-10、IFN-γ影响的研究[J].世界中西医结合杂志，2014，9(3)：254-256，275.

[15] 马鸣，赵连梅，杨兴肖，等.痰热清注射液可增强Lewis肺癌化疗小鼠的免疫功能[J].细胞与分子免疫学杂志，2015，31(3)：297-301.

[16] 陈冀衡，范志毅，张云霄，等.椎旁神经阻滞联合全麻与全麻下胸腔镜肺癌根治术病人肿瘤侵袭和转移风险的比较:VEGF和MMP-9血浓度[J].中华麻醉学杂志，2015，35(1)：23-26.

[17] 李真斌，齐协飞.血管抑素基因治疗Lewis肺癌移植瘤小鼠的实验研究[J].中国医学创新，2014，11(9)：26-28.

[18] 江联萍，谭越，成少华，等.重组人血管内皮抑素联合顺铂治疗肺癌合并恶性胸腔积液及恶性心包积液的疗效观察[J].实用临床医药杂志，2015，19(3)：20-22.

国家自然科学基金资助项目(81001103)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.008

R734.2

A

1002-266X(2016)20-0025-04

2015-11-11)