2型糖尿病患者Klotho基因G-395A多态性及其对合并下肢动脉粥样硬化的影响

赵燕，宋滇平，王艳，王玲，刘华，杨秋萍

(昆明医科大学第一附属医院，昆明650032)

2型糖尿病患者Klotho基因G-395A多态性及其对合并下肢动脉粥样硬化的影响

赵燕，宋滇平，王艳，王玲，刘华，杨秋萍

(昆明医科大学第一附属医院，昆明650032)

目的 观察2型糖尿病(T2DM)患者Klotho基因G-395A多态性，探讨其对合并下肢动脉粥样硬化的影响。方法 采用实时荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术，分别对205例健康体检者(汉族85例、彝族120例，对照组)、140例T2DM患者(汉族79例、彝族61例，T2DM组)及224例T2DM合并下肢动脉粥样硬化患者(汉族157例、彝族67例，动脉硬化组)的Klotho基因G-395A多态性进行检测，比较各组汉族、彝族基因型频率、等位基因频率，分析T2DM合并下肢动脉粥样硬化的危险因素。结果 动脉硬化组汉族Klotho基因G-395A位点GA+AA基因型频率高于彝族(P<0.05)，其余各组各等位基因及基因型频率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。汉族T2DM患者发生下肢动脉粥样硬化的影响因素为SBP、TG、LHL、空腹血糖(FPG)、Klotho基因G-395A位点GA+AA基因型(P均<0.05)，彝族为TG、LHL、FPG、血肌酐(P均<0.05)。结论 T2DM合并下肢动脉粥样硬化患者存在Klotho基因G-395A多态性，Klotho基因G-395A位点GA+AA基因型可能是云南省汉族部分T2DM患者发生下肢动脉粥样硬化的危险因素。

2型糖尿病；下肢动脉粥样硬化；Klotho基因；彝族；汉族；单核苷酸多态性

大血管病变是糖尿病的主要并发症之一，它是糖尿病致死的最主要原因。糖尿病大血管病变主要累及主动脉、冠状动脉、脑动脉和外周血管等，病理基础为动脉粥样硬化。Klotho基因是1997年日本学者 Kuro-O等[1]发现的、与衰老有关的基因，该基因缺陷可引起小鼠动脉硬化、骨质疏松、皮肤萎缩及肺气肿等疾病。Klotho基因变异在2型糖尿病(T2DM)及动脉粥样硬化发生、发展过程中发挥重要作用。彝族是云南省人口最多的少数民族之一，由于地理、历史和社会等原因，已形成独特的遗传隔离人群，有利于进行隔离人群遗传特点研究。目前尚未见对云南彝族Klotho基因G-395A多态性的相关研究。本研究观察T2DM患者Klotho基因G-395A多态性，探讨其对合并动脉粥样硬化的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2009年10月～2010年4月在昆明医科大学第一附属医院及楚雄州医院收治的单纯T2DM患者140例(T2DM组)，男86例、女54例，汉族79例、彝族61例，糖尿病病程(35.50±25.17)个月。T2DM合并下肢动脉硬化患者224例(动脉硬化组)，男116例、女108例，汉族157例、彝族67例，糖尿病病程(51.80±43.79)个月。T2DM诊断和分型均参照1999年WHO推荐标准；彩色多普勒超声显示股动脉内膜-中膜厚度(IMT)≥1.0 mm、局部有斑块或管腔狭窄诊断为下肢动脉粥样硬化。选择体检健康者205例为对照组，男124例、女81例，汉族85例、彝族120例，无糖尿病、高血压家族史。研究对象均为长期定居云南省昆明市、楚雄市，居住满20年，三代无外族通婚且相互间无血缘关系的汉族、彝族居民。三组性别、民族、糖尿病病程比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，其余临床资料比较见表1。

表1 三组一般临床资料比较

注：BUN为尿素氮，Scr为血肌酐，FPG为空腹血糖；与对照组比较，aP<0.05；与T2DM组比较，bP<0.05。

1.2 Klotho基因G-395A多态性检测 研究对象均禁食12 h，取空腹肘静脉血4 mL，置于EDTA抗凝管中室温放置30 min，分离血细胞、提取DNA。采用上海华舜生物技术有限公司柱式小量血液DNA抽提试剂盒抽提基因组DNA。采用实时荧光定量聚合酶链式反应(FQ-PCR)技术中的TaqMan荧光探针法检测G-395A(rs1207568)基因分型。将选定的G-395A(rs1207568)多态性位点在Applied Biosystems公司网站上查找相应的TaqMan-MGB探针，将探针标号及多态性位点一起送至Applied Biosystems公司合成引物及探针，按照其建议的PCR反应体系和反应条件进行检测。反应体系：20×引物及荧光探针混合溶液 0.5 μL，2×TaqMan通用PCR扩增预混试剂7.5 μL，ROX Reference Dye溶液0.3 μL，DNA模板1.5 μL，灭菌蒸馏水5.2 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min、94 ℃变性30 s、65 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共35个循环，最后72 ℃保温10 min。使用ABI Prism7300型荧光定量PCR扩增仪，按上述PCR反应体系和反应条件设定扩增程序后执行，扩增完成后根据FAM和VIC荧光信号的反应曲线，对未知样本进行G-395A基因型分析，分别选取不同基因型送至上海生工生物技术有限公司测序，并将测序结果与Klotho基因序列进行Blast比对。采用基因计数法计算各组基因型频率及等位基因频率。

2 结果

2.1 测序结果 G-395A位点存在3种基因型，分别为GG、GA、AA基因型。测序结果与FQ-PCR技术的基因分型结果一致，与Blast比对后显示一致。见图1。

2.2 各组彝族、汉族G-395A的基因型分布及等位基因频率比较 彝族人群Klotho基因 G-395A 的G等位和A等位基因频率分别为83.9%和16.1%，汉族人群分别为81.8%和82.0%。对照组及T2DM组Klotho基因G-395A位点基因型及等位基因频率分布在彝族、汉族之间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；动脉硬化组汉族Klotho基因G-395A位点GA+AA基因型频率高于彝族(P<0.05)，但二者等位基因频率比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

注：A、B、C箭头分别对应GG、GA、AA基因型。

图1 G-395A位点3种基因型测序结果

表2 各组彝族、汉族G-395A基因型及等位基因分布[例(%)]

注：AA型的期望频数<5，合并至GA型；与同组汉族比较，*P<0.05。

2.3 T2DM患者发生下肢动脉粥样硬化的影响因素 分别在汉族、彝族人群中，以糖尿病合并下肢动脉粥样硬化发生与否作为因变量，选择表1中两组之间有统计学差异的基本资料及Klotho基因G-395A位点GA+AA基因型为自变量，进行多因素Logistic多元回归分析，结果显示汉族T2DM患者发生下肢动脉粥样硬化的影响因素为SBP、TG、LHL、FPG、Klotho基因G-395A位点GA+AA基因型(P均<0.05)，彝族为TG、LHL、FPG、Scr(P均<0.05)。见表3、4。

表3 汉族T2DM患者发生下肢动脉粥样硬化影响因素的多元Logistic回归分析结果

3 讨论

糖尿病与动脉粥样硬化的发生、发展关系密切，国外学者根据二者间的相关性提出了“共同土壤”学说，认为胰岛素抵抗是导致心脑血管疾病代谢异常的根本原因。近年来随着对 Kotho基因研究的深入，发现Kotho基因不仅是衰老相关性基因，与衰老相关病理改变联系密切；同时，其通过相关分子机制对个体多种代谢进行干预，参与冠心病、糖尿病等疾病的发生、发展。Klotho基因长50 kb，由5个外显子和4个内含子组成，在人和小鼠中均定位于第13号染色体(13q12)，大鼠中定位于第12号染色体(12q12)。Klotho基因可通过调节某些离子通道、胰岛素样生长因子1(IGF-1)受体等细胞表面糖蛋白的活性而发挥作用。Klotho基因缺陷小鼠在出生4周后即可出现动脉硬化，并随鼠龄增加而加重，表现为主动脉严重钙化，肌性中动脉中层钙化、内膜增厚、肾脏小动脉严重钙化等，这些血管变化与人类动脉硬化非常相似；将外源性正常Klotho基因cDNA转导给Klotho缺陷小鼠，其动脉硬化程度可得到显著改善[1]。除对Klotho缺陷小鼠进行基因补救有效外，对存在多种动脉硬化危险因素的自发性T2DM大鼠导入Klotho基因同样可以改善内皮细胞功能，增加内皮细胞NO合成，减轻血管周围组织纤维化、逆转血管重塑、降低血压，对减轻动脉硬化具有重要作用[2]。Klotho基因在胰岛素和IGF-1信号通路中发挥重要调节作用。国内研究显示，T2DM患者血浆Klotho水平低于正常对照者，且胰岛素敏感指数是血浆Klotho水平的独立影响因素，提示Klotho基因可能参与胰岛素抵抗和T2DM的发生、发展，机制考虑为Klotho参与抗氧化应激、抗凋亡、改善内皮功能等[3]。

表4 彝族T2DM患者发生下肢动脉粥样硬化影响因素的多元Logistic回归分析结果

Klotho基因含有400多个单核苷酸多态性位点，人类Klotho 基因多个多态性位点与动脉硬化性疾病相关，如Kl-VS等位基因、G-395A多态性、C1818T多态性等[4,5]。其中G-395A位于启动子区，Klotho基因G-395A多态性可影响启动子的转录过程，电泳迁移率变动分析(EMSA)显示，由G等位基因形成的DNA蛋白复合物的量明显高于由A等位基因形成的量，提示G突变为A可能通过减少蛋白和启动子的结合而影响Klotho基因的功能[6]。近年来研究发现，G-395A位点可影响冠心病、血管性卒中、血脂异常、糖尿病、骨质疏松、胃癌等疾病的危险性[5,7,8]，是重要的遗传筛选标记及潜在的功能性多态性位点。

本研究的研究对象均为长期定居云南省昆明市、楚雄市，居住满20年，三代无族外通婚且相互间无血缘关系的汉族、彝族居民。结果显示，彝族人群Klotho基因 G-395A 的G等位和A等位基因频率分别为83.9%和16.1%，汉族人群分别为81.8%和82.0%，与韩国、日本人群接近[5,9]。动脉硬化组汉族Klotho基因G-395A位点GA+AA基因型频率高于彝族，提示汉族、彝族存在Klotho基因G-395A多态性；多元回归分析显示，汉族人群中糖尿病下肢动脉粥样硬化的发生与SBP、TG、LDL、FPG、Klotho基因G-395A位点GA+AA基因型相关，彝族人群则与FPG、TG、LDL、Scr相关。T2DM患者由于高血糖的长期刺激可导致其血糖、血脂、肝肾功能发生病理损伤，影响内皮细胞功能，促进下肢动脉血栓的形成。Klotho基因与T2DM患者发生动脉粥样硬化之间的关系复杂，目前认为Klotho基因减轻动脉粥样硬化的机制可能包括：①增加NO的合成。Klotho基因缺陷小鼠血管内皮细胞NO合成明显下降，经过与野生型小鼠进行联体结合后其NO合成可得到明显改善[10]。NO是扩张血管的主要化合物，可抑制血管平滑肌细胞增生，保护内皮细胞。②抑制p53/p21表达，保护内皮细胞[11]。p53/p21是衰老促进基因，对其抑制可以减缓内皮细胞衰老的进程。③促进新生血管形成。研究显示，Klotho基因敲除小鼠血管生成受到抑制[12]。Klotho基因敲除可引起骨质疏松、骨髓抑制等骨髓微环境改变，导致内皮前体细胞生成减少，其分化及迁移功能受损，抑制新生血管生成，促进动脉粥样硬化的发生、发展[11,13]。

综上所述，云南省汉族、彝族部分T2DM合并下肢动脉粥样硬化患者存在Klotho基因G-395A多态性，Klotho基因G-395A位点GA+AA基因型可能是汉族T2DM患者发生下肢动脉粥样硬化的危险因素。

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G-395A polymorphisms of Klotho gene in type 2 diabetes mellitus patients and its influence on combined lower limb atherosclerosis

ZHAOYan,SONGDianping,WANGYan,WANGLing,LIUHua,YANGQiuping

(TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalCollege,Kunming650032,China)

Objective To observe the G-395A polymorphisms of Klotho gene in type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients, and to investigate its influence on combined lower limb atherosclerosis. Methods The G-395A polymorphisms of Klotho gene from 205 cases of normal controls (85 cases of Han nationality, 120 cases of Yi nationality, control group), 140 cases of T2DM patients (79 cases of Han nationality, 61 cases of Yi nationality, T2DM group) and 224 cases of patients with lower limb atherosclerosis combined with T2DM (157 cases of Han nationality, 67 cases of Yi nationality, atherosclerosis group) were detected by real-time fluorescence quantification PCR (FQ-PCR). The genotype frequency and allele frequency were compared between each group, and the risk factors of T2DM combined with lower limb atherosclerosis were analyzed. Results The genotype frequency of Klotho gene G-395A site G/A+A/A in the atherosclerosis group of Han nationality was higher than that of Yi nationality (P<0.05). There was no significant difference in genotype and allele frequency among the rest groups (allP>0.05). The influence factors of T2DM patients with lower extremity atherosclerosis in Han nationality were systolic blood pressure, TG, LHL, fasting blood-glucose (FPG) and genotype of Klotho gene G-395A site G/A+A/A (allP<0.05). The influence factors of T2DM patients with lower extremity atherosclerosis in Yi nationality were TG, LHL, FPG and serum creatinine (allP<0.05). Conclusions There is gene polymorphism at G-395A of Klotho gene in T2DM patients with lower limb atherosclerosis. The Klotho gene G-395A site G/A+A/A genotype may be a genetic risk factor for the occurrence of lower limb atherosclerosis of T2DM patients in Han nationality.

diabetes mellitus, type 2; lower limb atherosclerosis; Klotho gene; Yi nationality; Han nationality; single nucleotide polymorphisms

云南省自然科学基金资助项目(2009CD166)。

赵燕(1979-)，女，主治医师，研究方向为糖尿病及其慢性并发症的诊治。E-mail: yanny8080@sohu.com

杨秋萍(1964-)，女，主任医师，研究方向为内分泌与代谢性疾病的诊治。E-mail: yqp22@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.004

R587.1

A

1002-266X(2016)28-0012-04

2015-12-01)