多西他赛联合BEZ235对Kras基因突变的肺腺癌A549细胞凋亡的影响及机制

程留奇，张中冕，王海莉，庄琰，李静

(郑州大学第二附属医院，郑州450000)

多西他赛联合BEZ235对Kras基因突变的肺腺癌A549细胞凋亡的影响及机制

程留奇，张中冕，王海莉，庄琰，李静

(郑州大学第二附属医院，郑州450000)

目的 观察多西他赛联合BEZ235不同作用方式对Kras基因突变的A549细胞凋亡的影响，探讨其作用机制。方法 体外培养Kras基因突变的人肺腺癌A549细胞，采用不同浓度多西他赛(2.5、5、10、20、40 μg/L)和BEZ235(1.25、2.5、5、10、20 μmol/L)干预24、48、72 h；MTT法检测细胞增殖抑制率，确定BEZ235的最佳干预浓度为17.5 μmol/L、多西他赛的最佳干预浓度为15.3 μg/L，二者最佳干预时间均为48 h。另取人肺腺癌A549细胞，随机分为对照组(耐药组)、多西他赛单药组、BEZ235单药组、BEZ235同步多西他赛组(两药同时应用)、多西他赛序贯BEZ235组(给予多西他赛24 h改用BEZ235 24 h)、BEZ235序贯多西他赛组(给予BEZ235 24 h改用多西他赛24 h)，均给予最佳干预时间及最佳干预浓度，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率，Western blotting法检测pAKT、pERK蛋白表达。结果 对照组、多西他赛单药组、BEZ235单药组、BEZ235同步多西他赛组、多西他赛序贯BEZ235组、BEZ235序贯多西他赛组A549细胞凋亡率逐渐升高(P均<0.05)，pAKT蛋白相对表达量逐渐降低(P均<0.05)。BEZ235单药组pERK蛋白相对表达量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但均高于其他各组(P均<0.05)。结论 多西他赛和BEZ235不同联合作用方式作用下均可促进Kras基因突变的A549细胞凋亡，以BEZ235序贯多西他赛效果最好；降低pAKT及pERK表达，协同抑制PI3K/AKT/mTOR和Raf/MEK/ERK通路可能是其作用机制。

肺癌；多西他赛；BEZ235；Kras基因； A549细胞

肺腺癌是肺癌的主要类型[1]，约20%的肺腺癌患者出现Kras基因突变[2]，这部分患者对多数靶向治疗药物不敏感[3]。Kras基因是ras基因家族的主要成员，人肿瘤细胞中Raf/MEK/ERK通路和PI3K/AKT/mTOR通路是ras信号传导通路下游的两条重要通路。多西他赛是目前肺腺癌的一线化疗药物，通过抑制细胞有丝分裂而发挥抗肿瘤作用。BEZ235是阻断PI3K和mTOR的双重靶向抑制剂。多西他赛可增强BEZ235对前列腺癌细胞的敏感性[4]，提示多西他赛可能对Raf/MEK/ERK通路有一定的抑制作用。2013年11月～2014年3月，本研究观察了多西他赛联合BEZ235不同作用方式对Kras基因突变的人肺腺癌A549细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Kras基因突变的人肺腺癌A549细胞株，由郑州大学第二附属医院实验室提供。BEZ235，购自上海翊圣生物科技有限公司；多西他赛，购自齐鲁制药有限公司。小鼠抗人p-AKT抗体、p-ERK抗体购自美国Santa Cruz公司。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；LAS4000型荧光图像分析仪，购自日本FUJIFILM公司。

1.2 细胞培养 取Kras基因突变的人肺腺癌A549细胞，置于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞呈单层贴壁生长，隔天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 多西他赛、BEZ235最佳浓度确定 取对数生长期A549细胞，调整细胞密度为5×104/mL，接种于96孔板，每孔200 μL，常规培养24 h；向96孔板加入药物，多西他赛浓度设置为2.5、5、10、20、40 μg/L，BEZ235浓度设置为1.25、2.5、5、10、20 μmol/L。另设一个空白孔和一个对照孔，分别加入等量的RPMI 1640培养基。分别于药物干预24、48、72 h时采用MTT法检测细胞增殖抑制率，确定多西他赛最佳干预时间及最佳干预浓度。结果显示，两药最佳干预时间均为48 h，多西他赛最佳干预浓度为15 μg/L、BEZ235为17.5 μmol/L。

1.4 细胞凋亡检测 取对数生长期A549细胞，调整细胞密度至5×104/mL，接种于96孔板，每孔200 μL，待细胞贴壁后，分为对照组(不加药物)、多西他赛单药组、BEZ235单药组、BEZ235同步多西他赛组(两药同时应用)、多西他赛序贯BEZ235组(给予多西他赛24 h改用BEZ235 24 h)、BEZ235序贯多西他赛组(给予BEZ235 24 h改用多西他赛24 h)。各组均采用1.3确定的最佳干预时间及干预浓度。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。实验重复3次，取平均值。

1.5 pAKT、pERK蛋白表达检测 采用Western blotting法。取对数生长期A549细胞，调整细胞密度至5×104/mL，接种于96孔板，每孔200 μL。实验分组及处理同1.4。各组培养48 h，采用RIPA蛋白裂解液收集各组细胞总蛋白，分别进行SDS-PAGE电泳、转膜、封闭，分别加入1∶1 000稀释的pAKT、pERK单克隆抗体及山羊抗鼠IgG杂交液(1∶5 000)。采用Image Quant LAS4000软件扫描各组对应条带的灰度值，计算pAKT、pERK蛋白相对表达量。

2 结果

对照组、多西他赛单药组、BEZ235单药组、BEZ235同步多西他赛组、多西他赛序贯BEZ235组、BEZ235序贯多西他赛组A549细胞凋亡率逐渐升高，pAKT蛋白相对表达量逐渐降低，各组间比较P均<0.05。BEZ235单药组ERK蛋白相对表达量与对照组比较差异无统计学意义(P<0.05)，但均高于其他各组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组细胞凋亡率及pAKT、pERK蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与多西他赛单药组比较，#P<0.05；与BEZ235单药组比较，△P<0.05；与BEZ235同步多西他赛组比较，▲P<0.05；与多西他赛序贯BEZ235组比较，▽P<0.05。

3 讨论

有研究证实，发生Kras基因突变的肺癌患者极少发生表皮生长因子受体(EGFR)突变或间变性淋巴瘤激酶(ALK)基因重组，因此应用靶向药物治疗效果欠佳[6，7]。BEZ235是PI3K/mTOR双靶点抑制剂，本课题组前期研究证实，BEZ235可抑制A549细胞AKT mRNA表达，但对Raf/MEK/MAPK通路并无明显影响[8]。BEZ235单独用于Kras基因突变的肺癌小鼠时效果欠佳，联合MEK抑制剂效果较好。对于存在MEK抑制剂抵抗的肺癌及直肠癌细胞株，BEZ235联合MEK抑制剂显示出更好的疗效。因此认为，Raf/MEK/ERK通路和PI3K/AKT/mTOR通路之间可能存在交互作用，PI3K级联和Raf级联在肺腺癌的进展中发挥关键作用[9,10]，即使在PI3K级联信号传导受阻时，细胞仍可以通过Raf级联调节肿瘤细胞的生物学特性[11]。Yasumizu等[4]针对前列腺癌细胞的研究显示，多西他赛可增强BEZ235的抗肿瘤作用，多西他赛可能同时对Raf/MEK/ERK通路及PI3K/AKT/mTOR通路有抑制作用。

本研究结果显示，BEZ235及多西他赛均能促进A549细胞凋亡，两药联合应用促凋亡效果更明显，且BEZ235序贯多西他赛组细胞凋亡率最高。AKT、ERK是PI3K/AKT/mTOR和Raf/MEK/ERK通路的关键因子，pAKT及pERK是二者的磷酸化(活化)形式。Western blotting结果显示，相对于对照组，BEZ235可降低pAKT表达、对pERK表达并无影响，而多西他赛可同时降低pAKT及pERK表达，两药联合相对于单药可进一步降低pAKT及pERK表达；提示多西他赛能同时抑制PI3K/AKT/mTOR和Raf/MEK/ERK通路；BEZ235序贯多西他赛显示出更好的抑制效果，原因可能为BEZ235可克服存在Kras基因突变的肺腺癌细胞对多西他赛治疗的抵抗，提示BEZ235与多西他赛在抑制Kras基因下游信号传导过程中具有协同作用。

综上所述，多西他赛和BEZ235不同联合作用方式下均可促进Kras基因突变的A549细胞凋亡，以BEZ235序贯多西他赛效果最好；降低pAKT及pERK表达，协同抑制PI3K/AKT/mTOR和Raf/MEK/ERK通路可能是上述结果产生的原因。

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