结缔组织生长因子对人眼Tenon囊成纤维细胞间质转化的影响及机制

罗钢，蔡丽英

(黄石市中心医院 湖北省理工学院附属医院，湖北黄石435000)

结缔组织生长因子对人眼Tenon囊成纤维细胞间质转化的影响及机制

罗钢，蔡丽英

(黄石市中心医院 湖北省理工学院附属医院，湖北黄石435000)

目的 观察结缔组织生长因子(CTGF)对人眼Tenon囊成纤维细胞间质转化的影响，探讨其作用机制。方法 体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞，取传代(第3代)细胞随机分为CTGF组和对照组，CTGF组用含50 ng/mL CTGF的DMEM培养基培养，对照组仅用DMEM培养基培养。培养48 h，采用实时荧光定量PCR法检测两组钙黏素E(E-cadherin)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Wnt信号通路相关基因β连环蛋白(β-catenin)、淋巴样增强因子1(Lef1)、Wnt基因家族2B(Wnt2B)、糖原合成酶激酶3(GSK-3β)mRNA相对表达量，Western blotting法检测E-cadherin和α-SMA蛋白相对表达量。结果 CTGF组β-catenin、Lef1、Wnt2B、GSK-3β mRNA相对表达量均高于对照组(P均<0.01)，E-cadherin、α-SMA mRNA及蛋白相对表达量均高于对照组(P均<0.01)。结论 CTGF可致人眼Tenon囊成纤维细胞发生间质转化，激活Wnt信号通路可能是其作用机制。

人眼Tenon囊成纤维细胞；结缔组织生长因子；细胞间质转化；Wnt信号通路

青光眼为眼科常见病，其病因复杂，对视力危害极大，是致盲的主要原因[1]。青光眼滤过术是临床治疗青光眼的常用方法，通过建立房水外引流而降低眼压，修复视功能[2]；但术后滤过区瘢痕形成常影响手术效果。研究表明，成纤维细胞异常黏附、增殖、间质-上皮转化及细胞外基质大量合成是导致青光眼滤过术后滤过区瘢痕形成的重要原因[3]。但人眼Tenon囊成纤维细胞在病理情况下是否发生间质转化鲜有报道。结缔组织生长因子(CTGF)作为一种新的致纤维化生长因子，在转化生长因子β下游发挥重要作用，是病理性纤维瘢痕化过程中的重要介质[4,5]。2014年6月～2015年7月，本研究观察了CTGF对人眼Tenon囊成纤维细胞间质转化的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 人眼Tenon囊成纤维细胞株来源于黄石市中心医院眼科中心。DMEM培养基(高糖型)购自上海高创化学科技有限公司，FBS购自南京安培化工科技有限公司，Wnt信号通路相关基因β连环蛋白(β-catenin)、淋巴样增强因子1(Lef1)、Wnt基因家族2B(Wnt2B)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)多克隆抗体均购自美国Abcam公司，钙黏素E(E-cadherin)抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，鼠抗人α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。TRIzol总RNA提取试剂盒购自美国Biomiga公司，逆转录试剂盒和PCR试剂盒均购自美国Fermentas公司。实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。CTGF购自美国Peprotech公司，采用0.1%牛血清白蛋白(BSA)液稀释，稀释浓度为50 ng/mL，分装于EP管中，置于-20 ℃冰箱保存，实验过程中根据所需质量浓度用DMEM培养液进行稀释。

1.2 人眼Tenon囊成纤维细胞培养及分组处理 将人眼Tenon囊成纤维细胞置于含10% FBS的DMEM培养基(高糖型)中，于5% CO2、恒温培养箱中培养至细胞融合达到80%，进行传代培养。传代后每24 h更换1次培养液，每3天进行1次传代，取第3代细胞完成后续实验。取传代培养生长良好的细胞，用胰蛋白酶进行消化，按照密度为6×104/mL接种于96孔板。随机分为CTGF组和对照组，CTGF组细胞培养液中加入50 ng/mL的 CTGF，于5% CO2培养箱中37 ℃恒温培养48 h；对照组仅在培养液中相同条件下培养48 h。

1.3 E-cadherin、α-SMA、β-catenin、Lef1、Wnt2B、GSK-3β mRNA表达检测 采用实时荧光定量PCR法。取两组贴壁培养48 h的细胞，将培养液弃去，PBS冲洗3次，细胞裂解液裂解细胞；采用TRIzol总RNA提取试剂盒提取总RNA，紫外分光光度计测定总RNA纯度，取A260/A280>1.80样品完成后续实验；采用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为模板链cDNA；以cDNA为模板，采用PCR试剂盒完成扩增。相关基因引物均由上海生工公司设计合成，引物序列见表1。PCR反应条件：95 ℃、45 s，92 ℃、30 s，56 ℃、15 s，74 ℃、15 s ，连续38个循环。每个样品均设置3个平行反应复孔。以内参GAPDH为对照，2-△△Ct法计算上述各基因mRNA的相对表达量。

表1 基因引物序列

1.4 E-cadherin和α-SMA蛋白表达检测 采用Western blotting法。取两组贴壁培养48 h的细胞，将培养液弃去，PBS冲洗3次，细胞裂解液裂解细胞；采用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，并用BCA法检测蛋白浓度；SDS-PAGE凝胶电泳，转膜至硝酸纤维膜；用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭60 min；TBST液进行洗膜30 min；加入一抗 E-cadherin抗体(1∶500)或鼠抗人α-SMA 单克隆抗体(1∶200)，于4 ℃下过夜孵育；洗膜，加入1∶1 000稀释的相应二抗，室温下孵育60 min。每个样品均重复3次实验，以β-actin为内参，用Quantity One凝胶图像分析软件分析条带灰度值，获得E-cadherin和α-SMA蛋白相对表达量。

2 结果

CTGF组β-catenin、Lef1、Wnt2B、GSK-3β mRNA相对表达量均高于对照组(P均<0.01)，见表2。CTGF组E-cadherin、α-SMA mRNA和蛋白相对表达量均高于对照组(P均<0.01)，见表3。

3 讨论

术后滤过区瘢痕形成为青光眼滤过手术术后常见不良反应，不利于患者术后视力恢复[6]。研究表明，瘢痕形成涉及多个过程，如细胞因子合成、释放，成纤维细胞迁移、活化、增殖和转化，细胞外基质降解等[7]。CTGF为纤维化过程中发挥关键作用的因子，在调控成纤维细胞增殖、迁移、分化及细胞外基质合成中发挥重要作用[8]。Zhang等[9]将CTGF注射到滤过泡内，观察到滤过通道瘢痕形成速度显著增加。亦有研究利用RNA干扰技术使人眼Tenon囊成纤维细胞中CTGF基因沉默，观察到细胞增殖能力被显著抑制[10]。上述研究均提示，CTGF与青光眼滤过手术术后滤过区瘢痕形成关系密切。

表2 两组β-catenin、Lef1、Wnt2B、GSK-3β mRNA相对表达量比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.01。

表3 两组E-cadherin、α-SMA mRNA及蛋白相对表达量比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.01。

E-cadherin是上皮细胞标志物，在正常间叶组织来源的成纤维细胞中几乎不表达，在维持细胞间黏附性、细胞极性及细胞间信息传递过程中发挥重要作用，其表达增加是间质-上皮转化的最显著特征。本研究CTGF组Tenon囊成纤维细胞中E-cadherin mRNA和蛋白相对表达量均高于对照组，提示CTGF可能促进成纤维细胞发生间质转化[11]。α-SMA为肌动蛋白家族成员，表达于血管平滑肌细胞和肌性上皮细胞，是人眼成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的标志物，其表达增加可加速细胞纤维化过程[12]。本研究CTGF组细胞中α-SMA mRNA和蛋白相对表达量均高于对照组，进一步说明CTGF可促进人眼Tenon囊成纤维细胞发生间质转化。

Wnt信号通路不仅在维持人体正常生理过程中发挥重要作用，而且与细胞转分化过程关系密切[13]。本研究CTGF组细胞中Wnt信号下游枢纽信号分子β-catenin、下游靶因子Lef1及Wnt配体Wnt2B相对表达量均高于对照组，而Wnt信号激活因子GSK-3β相对表达量则低于对照组，表明CTGF可能通过激活Wnt信号通路而促进人眼Tenon囊成纤维细胞发生间质转化；具体作用机制可能为在生理状态下GSK-3β通过降解β-catenin而抑制Wnt信号活性[14]，CTGF通过抑制GSK-3β活性进而导致β-catenin在细胞质内大量积累，并与胞核内TCF/LEF结合而诱导Wnt信号通路激活，促进成纤维细胞发生间质转化，E-cadherin大量表达，加速瘢痕形成。

综上所述，CTGF可致人眼Tenon囊成纤维细胞发生间质转化，激活Wnt信号通路可能是其作用机制。

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蔡丽英(E-mail: 2755229172@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.010

R775

A

1002-266X(2016)28-0031-03

2015-11-04)